中職檢驗專(zhuān)業(yè)白細胞計數實(shí)驗教學(xué)論文
摘要在運用顯微鏡計數法進(jìn)行白細胞計數的實(shí)驗教學(xué)中，容易出現一些問(wèn)題，如技術(shù)誤差、固有誤差、儀器誤差等。經(jīng)過(guò)多年的教學(xué)總結和仔細分析，得出一些相應的解決方法，以期共同探討。
關(guān)鍵詞中職檢驗專(zhuān)業(yè)；白細胞計數實(shí)驗；誤差
1引言
中職學(xué)校檢驗專(zhuān)業(yè)學(xué)生在進(jìn)行白細胞計數實(shí)驗中，容易出現實(shí)驗器材使用不當、實(shí)驗操作不規范或對實(shí)驗理論知識不理解而導致實(shí)驗結果偏差甚至實(shí)驗過(guò)程受阻等；另外，即使一位技術(shù)熟練者，使用同一儀器在對同一標本進(jìn)行連續多次操作，檢測結果也常有一定差異。本文提出白細胞計數實(shí)驗中容易出現的一些問(wèn)題即技術(shù)誤差、固有誤差以及儀器誤差等進(jìn)行分析探討且給出相應的解決方法，以盡力避免學(xué)生在實(shí)驗過(guò)程中出現的錯誤操作或無(wú)效操作，提高學(xué)生操作效率及能力，達到更好的教學(xué)效果。
2技術(shù)誤差
由于操作不正確或儀器不精確造成的誤差為技術(shù)誤差。這類(lèi)誤差通過(guò)主觀(guān)努力可以避免或降到最低程度[1]。采血部位不同結果產(chǎn)生偏差世界衛生組織（WHO）推薦采血部位以左手無(wú)名指或中指指尖的內側為宜。在我國有些地方仍采用耳垂取血，耳垂部位痛感較輕且不易感染，但其血循環(huán)較差，受溫度變化影響較大，所以一般情況下采用手指部位取血。在學(xué)生實(shí)驗操作時(shí)，筆者將30名學(xué)生同時(shí)采指血和耳垂血，分別進(jìn)行采血取樣進(jìn)行對照。計數結果是耳垂血白細胞數高于手指血白細胞數的為28例，約占93.3%，平均數值增高1.9×109/L。白細胞數目的多少可能與所在采血部位的血管深淺、粗細、血流速度、血液粘滯度等多種因素有關(guān)。耳垂白細胞計數偏高的主要原因可能是耳垂體積小散熱快，所處環(huán)境溫度低，血流慢，血液粘滯度大，白細胞易于沉積。手指則不然，手指活動(dòng)量大、體積大，溫度相對高，血流快，血液粘滯度小，白細胞不易沉積，所以這些可能是手指血白細胞計數偏低的主要原因[2]。計數板不清潔干燥1）計數板的清潔方法。血細胞計數板使用后，取下蓋玻片，用自來(lái)水沖洗，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免損壞網(wǎng)格刻度。洗后自行晾干或用吹風(fēng)機吹干，也可用95%的乙醇、無(wú)水乙醇、丙酮等有機溶劑脫水使其干燥。另外，計數板沖洗后,還要通過(guò)鏡檢觀(guān)察每小格內是否殘留菌體或其他沉淀物。若不干凈,則必須重復清洗直到干凈為止，干燥后方可放入盒內保存或使用。2）計數板上殘存水滴，會(huì )使充液不均，還會(huì )造成混合液濃度降低[3]。
解決方法：將計數板置于清潔環(huán)境，自然干燥或在空氣中快速揮動(dòng)，如急用也可輕輕甩掉計數板上水滴后再用濾紙片將殘存水分吸干。3）計數板上殘留纖維等雜質(zhì)影響鏡下觀(guān)察清晰度。解決方法：用流動(dòng)的清水洗凈計數板后再進(jìn)行上述具體操作。微量吸管使用不當本實(shí)驗采用一種改進(jìn)的`微量吸管，屬于醫療器械技術(shù)領(lǐng)域。它由氣囊和與之管通的吸管一體構成，氣囊與吸管管通一端的底部具有孔，吸管上標有刻度，故可在采取樣液時(shí)利用指壓?jiǎn)㈤]其孔實(shí)現準確性，該吸管具有造價(jià)低、精確度高、操作簡(jiǎn)便靈活的特點(diǎn)，又具有可作為一次性產(chǎn)品使用，能夠避免交叉感染等的優(yōu)點(diǎn)。1）微量吸管折斷。解決方法：微量吸管細長(cháng)易斷，在將其插入橡膠頭內時(shí)，應左手持橡膠頭（注意氣囊孔的控制），右手必須持住靠近微量吸管上端的部分輕輕操作，才能有效防止其折斷。2）微量吸管取樣混有氣泡。解決方法：取樣時(shí)，需將微量吸管末端完全浸入血樣末端，輕輕抽吸，才不會(huì )混入空氣。3）血樣進(jìn)入橡膠頭。解決方法：取樣前應先捏緊橡膠頭，封閉氣孔，取樣時(shí)將橡膠頭慢慢地、一點(diǎn)一點(diǎn)地松開(kāi)，如果松開(kāi)速度過(guò)快或力度過(guò)大，就會(huì )發(fā)生上述現象[4]。取樣操作不規范以用一次性定量（20μl）微量吸管取末梢血為例，
正確操作是：輕輕吸取末梢血到微量吸管第二個(gè)刻度線(xiàn)后再多取一點(diǎn)兒，此時(shí)右手捏穩橡膠頭不動(dòng)，左手持干棉球置于微量吸管管尖部位，右手輕捏橡膠頭擠出管內多余血樣至剛好到吸管第二個(gè)刻度線(xiàn)為止，此時(shí)再用左手的棉球將管尖外多余血液擦掉。上述每一步驟缺一不可。充液不當1）充液量過(guò)少造成充液缺損，過(guò)多則造成蓋玻片懸浮，細胞飄忽不定。2）充液時(shí)玻棒位置不正確，造成充液缺損或有氣泡。正確操作是：用玻棒蘸取適量混懸液后應輕輕接觸蓋玻片一角，讓液體自動(dòng)進(jìn)入計數池并剛好充滿(mǎn)后立即移走玻棒。3）充液時(shí)間延遲�；鞈乙和瓿珊髴⒓闯湟河^(guān)察計數，有實(shí)驗證明如果混懸液放置超過(guò)1.5分鐘以上在進(jìn)行充液計數操作，會(huì )使計數結果偏低[5]。白細胞在剛剛混勻的液體中均勻分布，而靜置超過(guò)1.5分鐘后白細胞會(huì )逐漸下沉，造成混懸液密度不均，在吸取上層液體充液進(jìn)行計數時(shí)會(huì )產(chǎn)生偏差[5]。低倍鏡下看不到計數池1）了解計數板的構造。血球計數板是一塊特制的厚型載玻片，載玻片上有4個(gè)槽構成3個(gè)平臺。中間的平臺較寬，其中間又被一短橫槽分隔成兩個(gè)計數區，每個(gè)計數區上面各刻有一方格網(wǎng)，每個(gè)方格網(wǎng)共分9個(gè)大方格，4個(gè)角的大方格作為白細胞計數用，每個(gè)大方格被單線(xiàn)劃分成16個(gè)中方格；最中央大方格被雙線(xiàn)劃分成25個(gè)中方格，而每個(gè)中方格又分成16個(gè)小方格，供計數密度較大的紅細胞計數時(shí)使用。每個(gè)計數區由400個(gè)小方格組成，計數區邊長(cháng)為1mm，則計數區的面積為lmm2，每個(gè)小方格的面積為1/400mm2。蓋上蓋玻片后，計數區的高度為0.1mm，所以每個(gè)計數區的體積為0.1mm3，每個(gè)小方格的體積為1/4000mm3。2）計數板放置位置不正確。
計數板有上下兩個(gè)相同的計數池，應將要觀(guān)察的、充好液的一側置于視野中央。3）光線(xiàn)過(guò)強。計數板放置好后，調整好焦距，如仍看不到計數池上的畫(huà)線(xiàn)，可能是光線(xiàn)過(guò)強的緣故，調整顯微鏡光圈或遮光鏡至視野較暗，再調整細準焦螺旋至視野清晰即可看到計數池上的畫(huà)線(xiàn)[6]。辨別不出計數池4個(gè)角大方格的位置，解決方法如下。1）先找到計數池內最中央的大方格，特點(diǎn)是橫線(xiàn)與豎線(xiàn)均為雙線(xiàn)劃分的含有25個(gè)中方格的大方格，也是線(xiàn)條最密集的大方格就是計數池內最中央的大方格。2）以最中央大方格為標的，分別沿上、下、左、右方向移動(dòng)計數板，找到外側兩邊為單線(xiàn)、內側兩邊為雙線(xiàn)的含16個(gè)中方格的大方格即分別為四個(gè)角上的大方格。顯微鏡下將雜質(zhì)誤認為白細胞1）粉塵顆粒。粉塵顆粒不具備細胞的基本形態(tài)，低倍鏡下白細胞呈圓形，細胞內有深色的核，上下微調細準焦螺旋白細胞具有折光性。2）氣泡。氣泡亦不具備細胞的基本形態(tài)，微調細準焦螺旋時(shí)鏡下顯現為無(wú)細胞結構的空圈。漏數或重復計數1）每一個(gè)角上的大方格都被劃分為16個(gè)中方格，計數時(shí)應以中方格為依據，按一定方向和順序計數，如從上到下、從左到右的順序。2）對壓線(xiàn)的白細胞應采取數上不數下、數左不數右的原則。
3固有誤差
由于因每次白細胞分布不可能完全相同而造成的偏差叫固有誤差[1]。計數池內細胞分布不均白細胞總數在正常參考范圍內時(shí)，若每個(gè)大方格的白細胞數值相差8個(gè)以上視為細胞分布嚴重不均，可能是混合液密度不均或充液不當，需輕輕搖勻混合液重新充液計數。根據統計學(xué)研究白細胞在技術(shù)池內的分布符合Poison分布。其變異系數CV=1/m，m代表計數池重復計數的白細胞均數。通過(guò)上式可以得出m越大，CV越小，所以計數范圍越大，計數細胞越多，計數域誤差越小。常規考核標準學(xué)生計數完畢后，通常要用常規計算標準公式來(lái)評判實(shí)驗結果是否達標，否則要重新采血充液計數。即：RCS=（4個(gè)大方格所數白細胞數最大值-最小值）／4個(gè)大方格所數白細胞平均數評價(jià)標準：白細胞≤4×109/L時(shí)，RCS＜0.3白細胞=（4.1～14.9）×109/L時(shí)，RCS＜0.2白細胞≥15×109/L時(shí)，RCS＜0.15超過(guò)上述標準為不合格。
4儀器誤差
計數板的鑒定要求計數板的臺面光滑、透明，畫(huà)線(xiàn)清晰，計數池畫(huà)線(xiàn)面積準確，必要時(shí)采用嚴格校正的目鏡測微計測量計數池的邊長(cháng)與底面積，用微米千分尺測量計數池的深度。美國國家標準局（NBS）規定每個(gè)大方格邊長(cháng)的誤差應小于1%，即1±0.01mm，深度誤差應小于2%，即0.1±0.002mm。若超過(guò)上述標準，應棄之不用。蓋玻片的標準蓋玻片應平整、光滑、無(wú)裂痕，厚薄均勻一致，可使用卡尺多點(diǎn)測量（至少在9個(gè)點(diǎn)），不均勻度在0.002mm之內，必要時(shí)采用平面平行儀進(jìn)行測量與評價(jià)，要求呈現密集平行的直線(xiàn)干涉條紋。最簡(jiǎn)單的評價(jià)方法是將潔凈的蓋片緊貼于干燥的平面玻璃上，若能吸附一定的時(shí)間不脫落，落下時(shí)呈弧線(xiàn)形旋轉，表示蓋片平整、厚薄均勻。同時(shí)，合格的蓋片放置在計數池表面后，與支持柱緊密接觸的部位可見(jiàn)到彩虹。精選出的蓋片與其他蓋片緊密重合后，在掠射光線(xiàn)下觀(guān)察，如見(jiàn)到完整平行的彩虹條紋表示另一枚蓋片質(zhì)量也達標。如果蓋玻片不達標勢必會(huì )影響實(shí)驗結果的準確性。
5其他情況
白細胞總數過(guò)低計數完成后，白細胞總數過(guò)低者（＜3×109/L），可擴大計數區域或重新加倍取血計數。白細胞總數過(guò)高對于白細胞總數過(guò)高者（＞15×109/L），可增加稀釋倍數重新計數，如若是外周血中有核紅細胞過(guò)多，必須再進(jìn)行白細胞分類(lèi)計數，然后用校正公式予以校正除去。校正公式[1]：白細胞總數=校正前白細胞數×［100/（100+100個(gè)白細胞中的有核紅細胞數）］
以上所述大致涵蓋了學(xué)生在白細胞計數實(shí)驗中容易出現的問(wèn)題，若能有效克服,必定會(huì )大大增強實(shí)驗結果的可靠性。另外，熟能生巧，該項實(shí)驗初次完成后，建議再利用一些課時(shí)進(jìn)行白細胞計數實(shí)驗的技能考試，強化規范操作，為日后進(jìn)行紅細胞計數及血小板計數等實(shí)驗打下良好基礎。
參考文獻
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