Beclin1基因研究論文

　　Beclin1基因也稱(chēng)BECN1基因，是一種自噬相關(guān)基因，它與Bcl-2基因相互拮抗調控自噬。自噬是細胞中初級溶酶體處理內源性底物的重要過(guò)程，同時(shí)參與維持細胞內蛋白代謝平衡及內環(huán)境穩定的維持，在清除廢物、結構重建以及細胞生長(cháng)發(fā)育中起重要作用。近來(lái)Ⅱ型程序性細胞死亡-自噬性細胞死亡研究迅速受到人們的關(guān)注。自噬曾被Science評為全球科技領(lǐng)域6個(gè)研究熱點(diǎn)之一。然而自噬性細胞死亡研究主要集中在腫瘤學(xué)領(lǐng)域，在寄生蟲(chóng)學(xué)領(lǐng)域還很少得以開(kāi)展，目前已有關(guān)于自噬在弓形蟲(chóng)感染致病中的作用的研究報道，其中一種觀(guān)點(diǎn)認為細胞自噬通過(guò)降解作能清除進(jìn)入胞內的弓形蟲(chóng)保護正常細胞不被感染，另一種觀(guān)點(diǎn)認為自噬參與弓形蟲(chóng)感染復制過(guò)程，抑制了宿主細胞自噬就抑制了弓形蟲(chóng)的增殖。然而關(guān)于細胞自噬在弓形蟲(chóng)感染致病過(guò)程中的具體作用，自噬途徑能否成為抗弓形蟲(chóng)治療的新靶點(diǎn)等還有待于深入研究。

　　本研究擬構建Beclin1基因的真核表達載體并通過(guò)脂質(zhì)體介導的方法將外源性Beclin1基因導入293T細胞，再以Western blot的方法驗證其在真核細胞內的表達，為進(jìn)一步探索外源性Beclin1基因對弓形蟲(chóng)生長(cháng)、增殖及新的致病機制等提供基礎資料。

　　材料與方法

　　1.材料

　　1.1 細胞和載體

　　293T細胞和真核表達載體pEGFP均由安徽醫科大學(xué)病原生物學(xué)教研室保存。

　　1.2 主要試劑及儀器

　　質(zhì)粒小量提取試劑盒為美國Axygen公司產(chǎn)品，Trizol試劑和Lipo2000為美國Invitrogen公司產(chǎn)品;BamHⅠ、EcoRⅠ和rTaq mix為日本TaKaRa公司產(chǎn)品;逆轉錄試劑盒為美國Fermentas公司產(chǎn)品;DNA 膠回收試劑盒為德國QIAGEN公司產(chǎn)品;鼠抗pEGFP為英國Abcam 公司產(chǎn)品;HRP標記山羊抗鼠IgG為北京全式金公司產(chǎn)品。

　　2.方法

　　2.1 RT-PCR擴增目的基因

　　根據Trizol試劑說(shuō)明書(shū)提取293T細胞的總RNA，按照逆轉錄試劑盒步驟將RNA逆轉錄成cDNA。以cDNA 為模板，以beclin1基因編碼區全長(cháng)擴增引物Beclin1-F(5′-CGGAATTCTATGGAAGGGTCTAAGACGTCC-3′)和Beclin1-R (5′-CGGGATCCTCATTTGTTATAAAATTGTGAGGACA-3′)，進(jìn)行PCR 反應。取PCR產(chǎn)物5μl，用含EB的1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，分析PCR擴增結果，按DNA膠回收試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行目的片段的回收和純化。

　　2.2 PCR 產(chǎn)物和載體pEGFP的酶切及純化

　　取PCR產(chǎn)物10μl，用限制性?xún)惹忻窧amHⅠ和EcoRⅠ進(jìn)行雙酶切反應，根據DNA 膠回收試劑盒說(shuō)明進(jìn)行酶切片段的回收和純化。

　　2.3 Beclin1基因與pEGFP的重組與鑒定

　　將雙酶切后膠回收的Beclin1和pEGFP按摩爾比3～10︰1的比例用1μl T4連接酶于16℃連接過(guò)夜，將連接產(chǎn)物轉化大腸埃希菌DH5α并進(jìn)行培養，從培養12h～16h的卡那抗性培養平板上挑取若干單克隆，分別放入3ml含卡那霉素的LB液體培養基中，于37℃以200r/min振搖過(guò)夜，按照質(zhì)粒提取試劑盒說(shuō)明提取質(zhì)粒。采用雙內切酶切法和PCR法鑒定重組基因，雙酶切、PCR鑒定正確的重組表達質(zhì)粒送上海生工公司測序，并進(jìn)行Blast比對分析。

　　2.4 Beclin1基因在真核細胞內的表達

　　通過(guò)脂質(zhì)體介導的方法分別將空載體pEGFP和pEGFP-Beclin1重組質(zhì)粒轉染到293T細胞內，24h后用熒光顯微鏡觀(guān)察轉染情況，提取轉染后細胞總蛋白，采用Westernblot檢測Beclin1基因編碼蛋白的表達情況。

　　結 果

　　1 目的基因Beclin1PCR擴增提取293T 細胞的總RNA，逆轉錄成cDNA，以cDNA為模板，用Beclin1基因全長(cháng)擴增引物Primer-F和Primer-R擴增得到Beclin1基因全長(cháng)編碼區片段，大小為1 353bp，與預期值一致。

　　2 pEGFP-Beclin1重組載體pEGFP-Beclin1的鑒定pEGFP-Beclin1經(jīng)過(guò)限制性?xún)惹忻窧amHⅠ和EcoRⅠ雙酶切得到1 353bp目的基因片段和約4 700bp的載體pEGFP片段，經(jīng)上海生物工程試劑公司測序，測序結果經(jīng)Blast比對與beclin1基因序列同源性為100%。

　　3 Beclin1蛋白在真核細胞內的表達用LiPo 2000分別介導pEGFP和pEGFP-Beclin1轉染293T細胞，24h后在熒光顯微鏡下觀(guān)察到綠色熒光;Western blot檢測出目的`蛋白，大小與預測一致。

　　討 論

　　弓形蟲(chóng)病是由專(zhuān)性細胞內寄生的弓形蟲(chóng)引起的人獸共患寄生蟲(chóng)病，在世界各地普遍流行�；脊�形蟲(chóng)病的孕婦可能將弓形蟲(chóng)傳染給胎兒，尤其當感染發(fā)生在妊娠頭3個(gè)月，可引起流產(chǎn)，甚至死胎，或生下發(fā)育缺陷的患兒，已被列為感染性致畸(TORCH)綜合征主要原因之一。對于免疫功能?chē)乐負p害或抑制者，弓形蟲(chóng)同樣是引起致死性病變的主要病原體之一。近年來(lái)隨著(zhù)人們生活水平的提高，飲食習慣的改變，食物來(lái)源的多樣化，飼養寵物的人數的增多，弓形蟲(chóng)感染呈上升趨勢。傳統的抗弓形蟲(chóng)藥物包括乙胺嘧啶、磺胺嘧啶等毒副作用較大，用藥時(shí)間長(cháng)，只能殺死速殖子，停藥后易復發(fā)，因而限制了其應用，至今仍缺少理想的治療弓形蟲(chóng)病藥物。

　　近年來(lái)，細胞自噬成為研究的熱點(diǎn)，Beclin1基因作為自噬相關(guān)基因倍受青睞。本實(shí)驗構建了pEGFP-Beclin1重組載體并檢測到該基因編碼的蛋白在真核細胞內表達，為深入探索beclin1基因在弓形蟲(chóng)感染致病作用中的影響，了解弓形蟲(chóng)新的致病機制以及弓形蟲(chóng)病的預防和治療打下了基礎。

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