基因工程在林木抗寒中的應用研究論文
摘要：文章綜述了基因工程在林木抗寒方面的研究進(jìn)展， 包括結構基因、順式作用元件、轉錄因子和轉基因技術(shù)。
關(guān)鍵詞：基因工程； 林木； 抗寒；
逆境會(huì )傷害植物， 嚴重時(shí)會(huì )導致死亡。當溫度下降到0℃以下時(shí)， 植物體內發(fā)生冰凍， 因而受傷甚至死亡， 這種現象稱(chēng)為凍害。樹(shù)木在生長(cháng)期中如遇到溫度的突然變化， 會(huì )打亂植物生理進(jìn)程的程序而造成傷害， 迄今為止， 尚沒(méi)有解決低溫凍害的根本辦法。隨著(zhù)基因工程的發(fā)展， 在樹(shù)木的抗寒性研究方面取得了進(jìn)展。本文就結構基因、順式作用元件、轉錄因子和轉基因技術(shù)在林木抗寒中的應用與研究進(jìn)展進(jìn)行了闡述， 以期為林木抗寒相關(guān)研究提供參考。
1 結構基因
結構基因是一類(lèi)編碼蛋白質(zhì)的基因， 大多數真核生物的基因是不連續基因。所謂不連續基因就是指基因的編碼序列在DNA分子上是不連續的， 被非編碼序列所隔開(kāi)。編碼的序列稱(chēng)為外顯子， 是一個(gè)基因表達為多肽鏈的部分；非編碼序列稱(chēng)為內含子， 又稱(chēng)插入序列。內含子只轉錄， 在前mRNA時(shí)被剪切掉。一些抗寒相關(guān)的結構基因， 通過(guò)轉錄形成RNA， 再通過(guò)翻譯形成相關(guān)的蛋白質(zhì)， 進(jìn)而表現出抗寒的特性。2003年， 李春霞從胡蘿卜中克隆得到抗凍蛋白基因， 并轉入山楊， 得到轉基因植株后經(jīng)PCR檢測獲得1株卡那霉素的轉基因株系， 結果表明目的基因AFP基因已被整合進(jìn)山楊基因組中[1]。2007年， Benedict等將擬南芥抗寒相關(guān)基因CBF1基因轉化到楊樹(shù)基因組中， 并證明該基因的成功表達可提高楊樹(shù)的抗寒性。
2 順式作用元件
順式作用元件， 位于結構基因的旁側， 包括啟動(dòng)子、增強子、應答元件。它是轉錄因子的結合位點(diǎn)， 并通過(guò)這種結合進(jìn)而調控下游基因轉錄， 確保轉錄的精確起始和轉錄效率。目前此方面在林木中研究較少， 相對滯后。此外， Li等[2]研究表明不同基因啟動(dòng)子對抗逆基因的表達作用不同， 其中cor15基因啟動(dòng)子要弱于cor15b基因啟動(dòng)子對抗逆基因表達活性的影響， 此外還發(fā)現這種影響不僅與順式作用元件種類(lèi)有關(guān)， 也與其數量密切相關(guān)。Khurana等[3]發(fā)現CCAAT—box和HSEs作為小分子熱激蛋白sHSP26啟動(dòng)子中重要的熱激元件在表達調控中起了決定性的作用。
3 轉錄因子
轉錄因子即能夠結合在基因上游的特異核苷酸序列上的蛋白質(zhì)， 并能調控該基因的轉錄。轉錄因子可以調控核糖核酸聚合酶 （RNA聚合酶， 或叫RNA合成酶） 與DNA模板的結合。同時(shí)在與該基因上游的啟動(dòng)子區域結合的同時(shí)， 轉錄因子還可以與其他一些轉錄因子形成轉錄因子復合體， 進(jìn)一步影響基因的轉錄， 進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的合成。2014年， 羅夢(mèng)雪等[4]從麻瘋樹(shù)基因組中克隆到一個(gè)CBF2基因 （命名為JcCBDF2） 。運用生物信息學(xué)的分析手段對該基因序列及其編碼的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行了分析， 結果表明， JcCBDF2蛋白中不止包含AP2/EREBP保守的結合結構域， 還具有CBF轉錄因子特征序列。實(shí)時(shí)熒光定量結果顯示基因主要在麻瘋樹(shù)葉片內轉錄表達， 對低溫脅迫極其敏感， 初步研究表明基因是低溫誘導型轉錄因子。趙天田， 王貴禧， 梁麗松等[5]根據平榛花芽轉錄本高通量測序的結果， 采用RACE—PCR技術(shù)克隆到平榛S4OQ基因， 并對基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量表達分析， 表明：平榛雌花芽中的表達量最高， 隨后表達量逐漸下降， 在不同器官中的表達具有差異性， 雄花序中表達量最高。楊杞， 白肖飛， 高陽(yáng)等[6]以沙冬青為試驗材料， 利用RT—PCR和RACE技術(shù)克隆了沙冬青CBF/DREB1基因cDNA序列， 并對其進(jìn)行了序列分析， 運用生物信息學(xué)預測其編碼的氨基酸序列具有CBF家族基因特有的AP2結構域。為進(jìn)一步研究植物抗逆和獲得抗性基因提供了新的候選基因。
4 其他
4。1 小G蛋白基因
小G蛋白分子量約為20—30KD具有GTP酶活性， 在多種細胞反應中起開(kāi)關(guān)作用。當小G蛋白與GTP結合時(shí)成為活化形式， 作用于下游分子并將其活化。當GTP水解成為GDP時(shí)， 小G蛋白恢復為非活化狀態(tài)。黃亞成等[7]從橡膠樹(shù)膠乳cDNA文庫中克隆1個(gè)小G蛋白的基因全長(cháng)， 進(jìn)行了聚類(lèi)和表達分析， 采用實(shí)時(shí)熒光定量的方法研究該基因低溫處理下的表達水平。結果顯示4℃低溫脅迫下該基因在橡膠樹(shù)幼苗根中的表達明顯受誘導且在脅迫初期表達最強， 后又有所下降， 為進(jìn)一步研究該基因的功能奠定了基礎。
4。2 microRNA
microRNA （或miRNA） 是指參與轉錄后基因的表達調控， 由內源基因編碼的非編碼單鏈RNA分子， 長(cháng)度約為22個(gè)核苷酸。目前， 關(guān)于MicroR—NA的調控機理還不太清楚。2012年， 張譯云[8]以毛白楊為材料， 進(jìn)行不同時(shí)間段 （0、8、14、20h） 的低溫脅迫 （4℃） 處理， 分別提取小片段RNAs （<200nt） ， 利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)研究毛白楊在低溫脅迫后12種miRNAs的.差異表達規律。結果顯示， miRNAs的表達在低溫脅迫下有顯著(zhù)變化， 且呈現動(dòng)態(tài)反應。在低溫脅迫下， 大部分miRNAs的表達受到抑制。miR168a、miR169ac、miR394a—3p、miR530a的表達量在各個(gè)時(shí)間段顯著(zhù)下調。表明， miRNAs在調控毛白楊對低溫脅迫的反應中起著(zhù)重要作用。2012年， 張譯云以毛白楊為試材， 通過(guò)構建microRNA的cDNA文庫， 經(jīng)高通量測序獲得144個(gè)保守microRNA和29個(gè)新microRNA， 并用生物信息學(xué)方法預測了新microRNA的101個(gè)靶基因， 且這些靶基因均與植物生長(cháng)或逆境脅迫密切相關(guān)。該研究對進(jìn)一步探討microRNA在毛白楊經(jīng)低溫脅迫后的調控機制具有重要意義。
5 林木抗寒展望
目前， 抗寒性研究是林業(yè)抗逆性研究中重要一項， 并已深化到基因水平。雖然轉基因技術(shù)存在一定的爭議而且植物抗寒性狀作為質(zhì)量性狀多受多基因控制， 抗寒分子機制相對復雜， 目前對這方面的研究仍不夠透徹， 經(jīng)基因轉化獲得的抗寒性植株還有很大的盲目性。但利用轉基因技術(shù)增加林木抗寒性， 并不涉及食品安全問(wèn)題， 同時(shí)一些寒冷脅迫應答基因已陸續被鑒定， 很多關(guān)鍵基因已通過(guò)轉基因技術(shù)成功提高了林木的抗寒性。近年來(lái)， 在大數據時(shí)代的潮流中， 基因芯片、轉錄組等高通量生物技術(shù)的成功應用進(jìn)一步加快了抗寒相關(guān)候選基因的鑒定， 因此運用基因工程技術(shù)改善植物抗寒性將擁有越來(lái)越好的前景。
參考文獻
[1]馮連榮， 宋立志， 林曉峰。楊樹(shù)抗寒育種研究進(jìn)展[J]。防護林科技， 2010 （1） ：92—94
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[3]Khurana N， Chauhan H， Khurana P。Wheat chloroplast targeted sHSP26promoter confers heat and abiotic stress inducible expression in transgenic Arabidopsis plants[J]。PLOS One， 2013， 8 （1） ：e54418
[4]羅夢(mèng)雪， 高繼海， 時(shí)小東， 等。麻瘋樹(shù)耐冷基因JcCBF2的克隆及表達模式分析[J]。四川大學(xué)學(xué)報， 2014， 51 （6）
[5]趙天田， 王貴禧， 梁麗松， 等。平榛ChWRKY2轉錄因子的克隆及在低溫脅迫下的表達分析[J]。林業(yè)科學(xué)研究， 2012， 25 （2） ：144—149
[6]楊杞， 白肖飛， 高陽(yáng)， 等。沙冬青CBF/DREB1轉錄因子的cDNA克隆及序列分析[J]�；蚪M學(xué)與應用生物學(xué)， 2009， 28 （6） ：1043—1048
[7]黃亞成， 秦云霞， 劉林婭， 等。橡膠樹(shù)HbRAN1基因的克隆與表達[J]。熱帶作物學(xué)報， 2013， 34 （7） ：1257—1263
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