分析辣椒素對P糖蛋白和細胞旁途經(jīng)轉運透過(guò)的作用論文
P-糖蛋白(P-gp)是限制藥物從血液循環(huán)進(jìn)入腦和從腸腔進(jìn)入上皮細胞的重要轉運蛋白[1]，故聯(lián)合使用P-gp抑制劑可以增加藥物經(jīng)腸道吸收。Hamilton等首次發(fā)現維拉帕米、環(huán)孢菌素A(CsA)能與化療藥物競爭性結合P-gp，逆轉大腸癌耐藥性(MDR)，但其心腎毒性及免疫抑制作用明顯，限制了臨床應用。近年來(lái)，一些植物化學(xué)和本草綱目中的藥物，也發(fā)現具有抑制P-gp功能的作用，如本派丙烷和姜黃，與合成的抑制劑相比它們具有更低的毒性。我們經(jīng)常食用的辣椒中所含的主要成分辣椒素(CAP)也表現出對P-gp功能的抑制作用。體外結腸癌Caco-2細胞實(shí)驗發(fā)現，辣椒素能夠抑制P-gp對地高辛的外排作用。由于眾多實(shí)驗結果均是采用細胞研究獲得，由于細胞的一些形態(tài)學(xué)和生理學(xué)的局限性，并且P-gp在腸道中的分布是不均勻的，因此采用細胞無(wú)法預測藥物對不同腸區段粘膜上P-gp的影響，所以我們采用Ussing chamber法分別研究了辣椒素對空腸、回腸和結腸粘膜上P-gp功能的影響，并用熒光素鈉(CF)作為細胞旁途徑藥物轉運方式的標志物進(jìn)行檢測。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 試劑 辣椒素(批號：048K5058V)，Hepes(批號：016K54331)，Trizma base(批號：103K5411)，羅丹明123(批號：046K3688)、熒光素鈉(批號：047K0676)均購于Sigma-Aldrich公司(St. Louis，MO，USA)。甲醇和乙腈為HPLC級別，購買(mǎi)自德國莫克公司。
1.1.2 儀器 熒光分光光度儀(美國Waters公司，型號為474);P13110S 電子天平，德國 Sartorins 生產(chǎn);7 mlUssing chamber裝置(美國Harvard公司)。1.1.3 動(dòng)物 SD大鼠，雄性，體質(zhì)量250±20 g，購于南方醫科大學(xué)實(shí)驗動(dòng)物中心，合格證號：SCXK 粵 2006-0015。動(dòng)物實(shí)驗的方法符合南方醫科大學(xué)實(shí)驗動(dòng)物倫理委員會(huì )的有關(guān)規定和要求。
1.2 方法
1.2.1 藥物溶液配制
1.2.1.1 Hepes-Tris 緩沖液的配制 取 Hepes 6 g 溶于800 ml蒸餾水中，使之完全溶解。通入混合氣體(95% O2，5% CO2)10 min后，加入1.8 ml KCl(3 mol·L-1)、1.8 mlCaCl2(1 mol·L- 1)、0.8 ml MgSO4(1 mol·L- 1)、8.18 gNaCl，完全溶解后用TrisRONGYE(1 mol· L-1)調節pH至7.4，再加入5 ml葡萄糖溶液(1 mol·L-1)，用蒸餾水稀釋至1000ml，混勻即得。
1.2.1.2 實(shí)驗溶液配制 分別將辣椒素與R123或CF溶解在pH 7.4的O2/CO2氣體飽和的Hepes-Tris緩沖液中，這種Hepes-Tris溶液每天制備，實(shí)驗用辣椒素質(zhì)量濃度為60mg·L-1，R123或CF最終質(zhì)量濃度均為4mg·L-1。
1.2.2 體外Ussing chamber實(shí)驗 SD大鼠禁食16~18 h，3%戊巴比妥鈉(12 ml· kg-1)腹腔注射麻醉，延腹中線(xiàn)將腹部切開(kāi)，取出空腸、回腸和結腸。分別用生理鹽水清洗干凈，置入冰浴的Hepes-Tris緩沖液中通混合氣(95% O2∶5% CO2)培養。剪取空腸適量，于冰浴板上迅速剝離漿膜側的漿膜層，將腸粘膜固定于擴散池上，回腸及結腸的操作方法與空腸相同。在擴散室加入7 mlR123或CF與CAP的混合液，接收室加入7 ml Hepes-Tris緩沖液(均預熱至37.5 ℃);37.5 ℃保溫，并通入混合氣體。分別于15、30、45、60、75、90和120 min在接收室取樣0.5 ml，并同時(shí)補充相同體積相同溫度的Hepes-Tris緩沖液。
1.2.3 定量方法的建立
1.2.3.1 R123和CF的測定方法學(xué)考察 R123的激發(fā)波長(cháng)為485 nm，發(fā)射波長(cháng)為535 nm，可在此波長(cháng)下測定R123 的熒光強度，空白無(wú)干擾，其熒光圖譜如圖 1。R123 在(15.625~500)g· L- 1，熒光強度對濃度進(jìn)行回歸，標準曲線(xiàn)回歸方程為：Y=1.0435X-1.0989，R2=0.9982，Y為吸光度，X為濃度�；厥章屎腿諆染芏确謩e為98.9%和1.9%。CF的激發(fā)波長(cháng)為480 nm，發(fā)射波長(cháng)為520 nm，可在此波長(cháng)下測定CF的熒光強度，空白無(wú)干擾，其熒光圖譜如圖2。CF在(7.8125~500)g·L-1，熒光強度對濃度進(jìn)行回歸，標準曲線(xiàn)回歸方程為：Y=0.639X+0.068，R2=0.999，Y為吸光度，X為濃度�；厥章屎腿諆染芏确謩e為97.8%和2.7%。
1.3 統計學(xué)分析計量資料統計結果用均數±標準差表示。所有實(shí)驗數據均采用SPSS 13.0統計軟件進(jìn)行顯著(zhù)性檢驗，各組中分泌方向累計透過(guò)率與吸收方向累計透過(guò)率的比較用重復測量數據的方差分析;各組間不同方向，不同分組的Papp比較用析因設計資料的方差分析。顯著(zhù)性標準為P<0.05。
2 結果
2.1 辣椒素對R123體外經(jīng)腸粘膜透過(guò)的影響考察辣椒素與R123對空腸、回腸和結腸粘膜透過(guò)吸收方向(M-S)和分泌方向(S-M)的經(jīng)時(shí)透過(guò)變化(圖3~5)。計算得到capsaicin組R123的M-S及S-M方向的表觀(guān)滲透系數Papp(×10-6cm· s-1)，與control組對比，表明R123對空腸粘膜吸收方向和分泌方向的透過(guò)均受到辣椒素的影響。但對R123經(jīng)回腸和結腸粘膜吸收方向和分泌方向的透過(guò)均未受到辣椒素的影響。
2.2 辣椒素對CF體外經(jīng)腸粘膜透過(guò)的影響考察辣椒素與CF同時(shí)進(jìn)行腸粘膜透過(guò)時(shí)，對CF經(jīng)空腸、回腸和結腸粘膜M-S方向和S-M方向透過(guò)的表觀(guān)滲透系數Papp影響見(jiàn)圖6。計算得到capsaicin組R123 和 CF 的 M-S 及 S-M 方向的表觀(guān)滲透系數 Papp(×10-6cm· s-1)，與空白組對比，CF經(jīng)空腸粘膜吸收方向和分泌方向的透過(guò)均受到辣椒素的影響。然而，辣椒素對CF在經(jīng)回腸和結腸粘膜透過(guò)過(guò)程中并未出現影響。
3 討論
P-gp作為一種能量依賴(lài)性藥物外排泵，大部分位于腸細胞頂側膜，能將粘膜端的藥物泵出到腸腔，即如文中所述的分泌方向，從而降低藥物的吸收，這是導致人體藥物耐藥的重要原因。R123是P-gp經(jīng)典底物，因其具有熒光特性，檢測方便，現在國際上用于評價(jià)P-gp功能活性研究。有研究表明，P-gp及其相應基因Mdr1在腸道內的分布，其表達量沿腸腔從空腸到結腸逐漸升高，這與前期Ussing Chamber實(shí)驗中證實(shí)R123在小腸中轉運以分泌為主結果相符，因此選擇R123作為研究辣椒素對P-gp經(jīng)腸透過(guò)影響的指示藥物。CF與R123轉運機制不同，通過(guò)細胞旁途徑透過(guò)腸粘膜，廣泛用作細胞旁途徑藥物轉運方式標志物應用于實(shí)驗中，具有可見(jiàn)光范圍的熒光。用CF作為對照，更能完善實(shí)驗內容，輔證實(shí)驗結果。目前Ussing Chamber擴散池法被認為是研究底物透膜轉運行為的標準方法，應用Ussing Chamber模型獲得藥物的Papp與人口服吸收分數之間存在良好相關(guān)性，具有模擬為腸道環(huán)境的特點(diǎn)，操作簡(jiǎn)單，成本較低，易于推廣，作為生物藥劑學(xué)研究的'新方法，近年在國外應用較多，特別為腸段的分段定位研究提供有效研究手段。
由于藥物吸收是從腸腔先透過(guò)至粘膜層的上皮細胞，而后再到固有層，固有層存在很多微血管和淋巴細胞，藥物在此能被吸收如血液循環(huán)，導致很小的一部分透過(guò)粘膜肌層。因此，需要分離除去腸粘膜上的肌層組織，這是Ussing Chamber實(shí)驗法的難點(diǎn)及技術(shù)關(guān)鍵。在亞洲，辣椒是一種廣為使用的調味品，尤其在東南亞地區，辣椒素在食譜中占據很大比重，辣椒在血漿中含量可達到8~25 μmol/L。因此，體內辣椒素可能通過(guò)影響腸道內P-gp功能，而對同服的某些P-gp底物藥物(如環(huán)孢素等)在腸道內透過(guò)吸收產(chǎn)生影響，尤其是對于治療窗較窄，易受P-gp外排嚴重影響的藥物。實(shí)驗使用體外UssingChamber技術(shù)考察辣椒素對R123經(jīng)空腸、回腸和結腸粘膜吸收(M-S)方向和分泌(S-M)方向的影響，發(fā)現經(jīng)空腸粘膜透過(guò)時(shí)，R123的M-S方向與空白組相比顯著(zhù)增高，S-M方向顯著(zhù)降低，表明R123經(jīng)空腸粘膜M-S方向和S-M方向的透過(guò)均受到辣椒素的影響，而回腸及結腸粘膜透過(guò)時(shí)，M-S組及S-M組表觀(guān)滲透系數Papp與空白組相比均沒(méi)有顯著(zhù)性差異，說(shuō)明辣椒素在空腸透過(guò)時(shí)抑制了P-gp的功能，改變了R123經(jīng)空腸粘膜的透過(guò)性。而辣椒素在回腸和結腸對R123 的透過(guò)沒(méi)有影響，這可能跟 P-gp 及其相應基因Mdr1在腸道內的分布表達量沿腸腔從空腸到結腸逐漸升高有關(guān)，因此對于空腸粘膜上的P-gp蛋白影響更劇烈，而對于回腸及結腸粘膜上的P-gp可能需要更高濃度的辣椒素才能夠發(fā)揮作用。同時(shí)，為了輔證旁細胞途徑是否影響藥物轉運，選用CF作為標志物進(jìn)行檢測。經(jīng)空腸粘膜透過(guò)時(shí)，M-S組及S-M組分別與空白組相比，均具有顯著(zhù)性差異;經(jīng)回腸和結腸粘膜透過(guò)與空白組相比沒(méi)有顯著(zhù)性差異，提示辣椒素僅對空腸粘膜上旁細胞通路有影響，卻并沒(méi)有改變回腸和結腸腸粘膜上緊密連接的狀態(tài)。
有研究表明，P-gp表達量沿腸腔從空腸到結腸逐漸升高，而辣椒素僅在空腸中顯示出對R123透過(guò)的影響，暗示辣椒素可能是一種較弱的P-gp抑制劑。腸道中緊密連接也呈現相似的表達情況，辣椒素對于CF的透過(guò)增強作用同樣只存在于空腸，表明辣椒素對藥物吸收主要部位——空腸具有粘膜改善作用。因而，喜愛(ài)食用辣椒的患者在使用P-gp底物類(lèi)藥物和經(jīng)旁細胞通道轉運吸收藥物時(shí)，其體內藥物吸收情況值得關(guān)注。有關(guān)辣椒素對腸粘膜上P-gp影響的體內In situ大鼠實(shí)驗正在進(jìn)行中。因此，辣椒素抑制P-gp功能從而影響P-gp底物R123經(jīng)腸粘膜透過(guò)的作用具有腸段差異性，對R123和CF的影響僅僅存在于空腸，而在回腸和結腸卻影響很小，這可能與P-gp和緊密連接在腸粘膜上的分布是從空腸到結腸逐漸變化的分布有關(guān)。實(shí)驗結果與傳統意義上服藥要忌辛忌辣有矛盾。本實(shí)驗思路能為后續研究ABC外排轉運體提供指導，而且能為臨床用藥提供更可靠的理論依據。
【分析辣椒素對P糖蛋白和細胞旁途經(jīng)轉運透過(guò)的作用論文】相關(guān)文章：
糖蛋白的作用是什么09-20
林業(yè)生產(chǎn)建設的地位和作用分析論文08-25
細胞壁有篩選透過(guò)性嗎09-30
細胞壁有選擇透過(guò)性嗎10-08
地方志的發(fā)展史和作用分析的論文05-25
水在細胞中的作用03-01
論文分析同伴關(guān)系的中介作用07-02