開(kāi)口箭活性部位抗腫瘤細胞作用研究論文
1 材料與儀器
1.1 細胞株人宮頸癌細胞（Hela）、人肝癌細胞（HepG2）均由三峽大學(xué)分子生物學(xué)研究所提供。
1.2 藥品與儀器RPMI-1640為美國GIBCO公司產(chǎn)品；新生小牛血清為杭州四季青生物材料有限公司產(chǎn)品；HEPES為美國Sigma公司產(chǎn)品；胰蛋白酶為美國GIBCO公司產(chǎn)品；四氮唑藍（MTT）為美國AMRESCO公司產(chǎn)品；環(huán)磷酰胺 （CP,江蘇恒瑞醫藥股份有限公司，批號：07020121）。酶聯(lián)免疫檢測儀（GENIOS TECAN）；CO2培養箱（日本三洋公司）；LD4-2A離心機（北京醫用離心機廠(chǎng)）；96孔板（美國Cornning公司）。開(kāi)口箭根莖于2002-07采自湖北省神農架林區，經(jīng)三峽大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院陳發(fā)菊副教授鑒定為T(mén)upistra chinensis Bak.，標本存放于湖北省天然產(chǎn)物研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗室（No.TC200207SNJ）。
2 方法
2.1 藥物制備開(kāi)口箭根莖粉碎后，用甲醇回流提取，合并提取液，濃縮后經(jīng)氯仿脫脂后用水飽和的正丁醇萃取，旋轉蒸發(fā)回收正丁醇，濃縮液抽干后即得到開(kāi)口箭總皂苷，配成水液，過(guò)大孔樹(shù)脂柱，水洗， 30%乙醇、70%乙醇、95%乙醇梯度洗脫，得開(kāi)口箭4部分皂苷。分別取開(kāi)口箭總皂苷、30%開(kāi)口箭皂苷、70%開(kāi)口箭皂苷兩個(gè)樣品，用PBS配制成所需濃度，依次為312.5，625，1 250，2 500，5 000，10 000 μg/ml， 70%開(kāi)口箭皂苷用PBS配制成所需濃度，依次為156.25，312.5，625，1 250，2 500，5 000 μg/ml，所有受試樣品均用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌。環(huán)磷酰胺 （CP）用DMSO將其配置為500 mg/ml。
2.2 細胞培養 Hela和HepG2細胞用RPMI-1640培養液（另加10mmol/L HEPES、2.0 mg/mlNaHCO3、100 U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素和10%新生小牛血清），于CO2孵箱中37℃，5%CO2飽和濕度下培養。貼壁細胞用0.25%胰蛋白酶消化傳代。
2.3 開(kāi)口箭活性部位對Hela和HepG2細胞殺傷作用最佳實(shí)驗條件的選擇MTT法實(shí)驗條件的初步優(yōu)化，主要是對溶解藥物的.溶劑（水、PBS）、加藥前的培養時(shí)間（6，12，24 h）、藥物劑量和細胞密度進(jìn)行了摸索。其中密度細胞分別取0.1×105，0.5×105，0.8×105，1×105個(gè)/ml,接種于96孔培養板，每孔接種100 μl，轉板24 h后加不同濃度的開(kāi)口箭活性部位，繼續培養48 h，以MTT法測定吸光度，比較不同細胞密度的線(xiàn)性關(guān)系。
2.4 MTT比色法［6］MTT比色法按Mosmann氏法略加改進(jìn)。將處于對數生長(cháng)期的細胞制成單細胞懸液，調整細胞濃度為0.5×105個(gè)/ml,接種于96孔培養板，每孔接種100 μl，轉板24 h后加100 μl受試藥，另設陰性對照組（不加藥）、空白調零組（只有PBS）和陽(yáng)性對照組（環(huán)磷酰胺組），每組均設3個(gè)復孔，培養48 h，吸棄上清后加MTT（5 mg/ml）100 μl,繼續培養4 h后，棄去上清液，加DMSO 100 μl,用全自動(dòng)酶聯(lián)免疫檢測儀于570 nm波長(cháng)處測定吸光度（OD）值［7］，求出IC50。抑制率（%）=［陰性對照A570- 加藥組A570］/ 陰性對照A570×100%。
2.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡和細胞周期分1×106個(gè)細胞于培養瓶，陰性對照組0.5×106個(gè)細胞每瓶，培養24 h；吸棄部分上清后加藥混勻（開(kāi)口箭總皂苷、30%皂苷終濃度2 500μg/ml，70%皂苷和環(huán)磷酰胺終濃度1 250 μg/ml），繼續培養48 h；于5%CO2培養箱中培養48 h后，收集上清于相應標簽離心管中，各加1 ml胰酶消化，加4 ml培養液于該培養瓶中，并一起吸至各相應離心管中，各瓶加入5 ml PBS洗滌，洗滌液一起吸入相應離心管中，以2 000 r/min離心5 min；吸棄上清，加入1 ml 80%乙醇和0.5 mmol/LEDTA（Na）2的PBS混合液懸起細胞，輕輕混勻，于4℃固定30 min；棄上清，加PBS 10 ml混勻，以2 000 r/min離心5 min；用500 μl含0.1%TritonX-100 和50 μg/ml RNase的PBS懸起細胞，轉置測定管中，加溴化丙錠PI 100 μl，避光染色17 min（一般15～20 min）；濾膜過(guò)濾后上機。
3 結果
開(kāi)口箭活性部位對Hela和HepG2細胞殺傷作用最佳實(shí)驗條件的選擇為了得到相對穩定并且可靠的實(shí)驗結果，通過(guò)前期預實(shí)驗并結合大量資料，對該MTT法實(shí)驗條件進(jìn)行了初步優(yōu)化，主要是對溶解藥物的溶劑、加藥前的培養時(shí)間、藥物劑量和細胞密度進(jìn)行了探索。對于溶劑，最初采用的溶劑是水，通過(guò)對照發(fā)現溶解藥物的水對細胞的影響很小，但并非沒(méi)有，所以正式實(shí)驗采用PBS溶解藥物；對于加藥前的培養時(shí)間采用了6，12，24 h 3個(gè)時(shí)間，通過(guò)顯微鏡觀(guān)察發(fā)現加藥前培養24 h細胞狀態(tài)良好，由此選用了加藥前培養24 h；
對于藥物劑量，通過(guò)多次預實(shí)驗，最終選擇了最高濃度開(kāi)口箭總皂苷、30%皂苷為10 000 μg/ml，70%皂苷為5 000 μg/ml，而環(huán)磷酰胺為20 000 μg/ml；對于細胞密度，通過(guò)多次預實(shí)驗，采用5種細胞密度即0.1×105，0.5×105，0.8×105，1×105個(gè)/ml，同樣的藥物濃度情況下，開(kāi)口箭活性部位對Hela細胞生長(cháng)抑制呈最好線(xiàn)性關(guān)系的細胞密度是0.5×105 個(gè)/ ml，由此選擇最佳細胞濃度是0.5×105個(gè)/ml。通過(guò)這些因素的優(yōu)化，從而初步排除了其他非藥物因素對細胞的影響；而且這兩種腫瘤細胞的MTT實(shí)驗在同一批進(jìn)行實(shí)驗，排除了不同環(huán)境的干擾，從而得出實(shí)驗結果。
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