淺談基因工程在番茄抗旱方面的作用論文
摘要：番茄抗旱性是由許多微效基因座和數百個(gè)影響干旱形態(tài)和生理反應的基因控制的, 闡明番茄抗旱的分子機制、開(kāi)發(fā)分子標記輔助選擇將有助于加速培育具有抗旱性的番茄新品種。本文概述了番茄抗旱分子機制的研究進(jìn)展、番茄在干旱條件下的形態(tài)特征變化和抗旱育種, 重點(diǎn)闡述了番茄抗旱性基因工程改良方面的研究進(jìn)展, 為進(jìn)一步應用現代生物技術(shù)進(jìn)行植物抗旱性基因工程改良和分子標記輔助選擇育種提供方法和思路。
關(guān)鍵詞：番茄; 抗旱; 育種; 基因工程; 綜述;
中國人口眾多, 農業(yè)生產(chǎn)所用的淡水資源十分匱乏, 人均僅有2 200 m3, 是全球人均淡水資源最貧乏的國家之一 (王海波, 2011) 。干旱缺水在眾多非生物脅迫中是最具破壞性的, 同時(shí)也是限制作物產(chǎn)量和品質(zhì)的一個(gè)重要影響因素 (Tuberosa&Salvi, 2006) 。其中生殖生長(cháng)期受干旱影響最大, 在生殖階段干旱脅迫可以直接導致作物的產(chǎn)量損失大于50% (Boyer, 1982) 。
干旱脅迫通常伴隨著(zhù)熱脅迫或其他脅迫, 植物使用多種策略來(lái)響應干旱脅迫并且通過(guò)多種信號級聯(lián)和滲透調節等形態(tài)和生理改變以適應干旱。Levitt (1981) 認為, 植物適應干旱的機理可分為避旱、御旱和耐旱, 并且將御旱性和耐旱性統稱(chēng)為抗旱性。避旱即植物在干旱來(lái)臨之前加速發(fā)芽, 縮短生命周期以避免干旱脅迫;御旱即植物在干旱初期, 脅迫尚不嚴重時(shí), 通過(guò)改變地上部和根系性狀以減少水分損失, 維持較高的水勢, 以應對干旱脅迫;耐旱即植物演變出一系列的緩解機制如積累滲透保護劑, 防止細胞內水分散失;產(chǎn)生脅迫感應信號, 抗氧化劑和活性氧 (ROS) 清除劑;降低光合酶活性以降低光合作用等生理生化反應, 在嚴重干旱脅迫下維持細胞結構的穩定性。盡管已經(jīng)有一些策略能夠提高植物的抗旱性, 但由于抗旱性狀的生理和遺傳復雜性, 在改善抗旱性或開(kāi)發(fā)抗旱品種方面進(jìn)展緩慢。
番茄 (Solanum lycopersicum L.) 是全世界栽培最廣泛的蔬菜作物之一, 全球番茄產(chǎn)量達到1.6億t, 其中超過(guò)30%產(chǎn)自中國 (聯(lián)合國糧農組織,同時(shí), 番茄也是植物科學(xué)研究的重要模式植物之一。番茄原產(chǎn)地在南美洲熱帶地區, 屬于需水量較多的一種蔬菜作物, 環(huán)境脅迫中干旱脅迫是限制番茄產(chǎn)量和品質(zhì)的主要制約因素 (柏成壽和陸幗一, 1991) 。因此選育抗旱性強的番茄品種是重要的育種目標。目前, 主要通過(guò)常規育種、生物技術(shù)或兩者結合的方法改良植物的抗旱性。近年來(lái), 諸多學(xué)者圍繞著(zhù)番茄抗旱性做了大量頗具價(jià)值的研究工作, 為番茄抗旱性的改良奠定了基礎。
1 干旱對番茄形態(tài)特征的影響
1.1 干旱對番茄根系的影響
根系發(fā)育直接受環(huán)境因素的影響, 擁有一個(gè)健壯的根系對于提高作物的抗旱性非常重要。最具代表性的智利番茄 (S.chilense) 生長(cháng)在世界上最干旱的地區, 其發(fā)達的根系能夠促進(jìn)植株吸收深層土壤的水分 (Chetelat et al., 2009) 。Champoux等 (1995) 認為, 水稻根系厚度、根系表面積、每分蘗根干質(zhì)量、最大根深度和根/莖比均與田間抗旱性呈正相關(guān)。楊再強等 (2016) 發(fā)現, 在干旱脅迫時(shí)土壤中番茄的淺層根系會(huì )減少, 根系深扎、根表面積增加, 然而隨著(zhù)干旱脅迫的加劇, 植物正常的生長(cháng)機制遭到破壞, 導致根長(cháng)、根表面積和根尖數等降低, 根系的正常生長(cháng)受到顯著(zhù)抑制。
1.2 干旱對番茄葉片的影響
水分脅迫或其他逆境信號會(huì )誘導多種離子進(jìn)出保衛細胞, 造成保衛細胞內成分發(fā)生變化, 從而導致保衛細胞形態(tài)改變, 造成氣孔關(guān)閉、卷葉、植物的蒸騰速率降低, 與植物抗旱性有關(guān)的葉片性狀包括葉片形狀 (卷葉) 、角質(zhì)層、氣孔密度、氣孔孔徑、葉片滲透調節等。
Kadioglua等 (2012) 發(fā)現, 水稻、玉米、小麥和高粱等作物的葉片適度卷曲可以改變植物葉片結構, 增強光合作用, 通過(guò)減少水分蒸發(fā)流失延遲衰老并增加冠層光透射。當干旱脅迫嚴重時(shí), 通過(guò)誘導并加速植物葉片的衰老來(lái)減少綠葉面積, 從而減少蒸騰和水分的消耗 (安玉艷和梁宗鎖, 2012) 。但是在作物生產(chǎn)中, 干旱脅迫引起的葉片衰老, 導致干旱解除后作物冠層面積的'減少和光合同化能力的降低, 進(jìn)而引起整株早衰并最終導致作物產(chǎn)量和品質(zhì)的下降 (Rivero et al., 2007) 。
氣孔在控制植物蒸騰失水、降低葉片表面的高溫、吸收CO2進(jìn)行光合作用以及促進(jìn)植物生長(cháng)方面扮演著(zhù)極其重要的角色 (Damour et al., 2010) 。番茄氣孔大部分集中于葉片下表皮, 葉片下表皮的氣孔密度遠遠大于上表皮;隨著(zhù)土壤水分虧缺強度的增加, 葉片上表皮氣孔密度逐漸增大, 而下表皮氣孔密度呈現先減小后增大的趨勢 (劉朝霞, 2016) 。潘那利番茄 (S.pennellii) 葉片表皮具有較多氣孔, 可吸收和利用空氣中的水分, 并且葉片上有豐富的蠟質(zhì), 可以降低干旱情況下的水分喪失, 對干旱脅迫具有明顯的耐受性 (Chetelat et al., 2009) 。
2 番茄抗旱性育種的研究進(jìn)展
種質(zhì)資源是育種的基礎。由于番茄是一種嚴格的自花授粉植物, 經(jīng)過(guò)長(cháng)期的馴化和選育, 番茄的遺傳背景逐漸變窄 (Rick, 1986) 。因此, 通過(guò)廣泛的育種策略豐富番茄的種質(zhì)資源對番茄育種極其重要。研究人員正努力通過(guò)常規育種技術(shù)、分子輔助育種和轉基因技術(shù)等育種方法獲得抗旱性強的番茄品種。
2.1 番茄抗旱性基因工程改良研究進(jìn)展
轉基因技術(shù)能夠打破物種界限、克服生殖障礙, 把重要的抗旱基因整合到品種中, 能夠快速、有效地改良作物的抗旱性。植物為了適應干旱脅迫, 進(jìn)化出多個(gè)調節不同干旱響應基因的互作信號傳遞鏈, 這些干旱響應基因用于產(chǎn)生在干旱條件下起作用以增強植物抗性的蛋白質(zhì), 如轉錄因子 (TF) 、酶、分子伴侶和其他功能性蛋白等。目前, 已經(jīng)有很多基因通過(guò)超量或抑制表達來(lái)檢測基因在植物抗旱中的作用, 并且取得了很大的進(jìn)展, 這些在抗旱中有功能的基因不但可以直接改良植物的抗旱性, 也可以開(kāi)發(fā)標記, 為分子標記輔助選擇 (MAS) 育種奠定基礎。
2.1.1 抗旱相關(guān)轉錄因子
植物堿性亮氨酸拉鏈蛋白 (b ZIP) 、干旱響應元件結合蛋白 (DREB) 、NAC和鋅指 (Zinc finger) 蛋白等編碼多種TF家族成員, 能夠提高植物抗旱性 (Yamaguchi-Shinozaki&Shinozaki, 2006;Ariel et al., 2007;Ciftci-Yilmaz&Mittler, 2008;Fang et al., 2008) , 這些TF基因的異位表達或抑制可能激活多種脅迫耐旱機制。
植物的b ZIP轉錄因子能通過(guò)參與脫落酸 (ABA) 信號轉導途徑, 調控植物對干旱脅迫的反應。Orellana等 (2010) 研究Sl AREB1在番茄中的功能作用時(shí), 將Sl AREB1基因在番茄中超量表達, 轉基因番茄植株顯著(zhù)提高了對干旱和高鹽脅迫的耐受性, 同時(shí)大規�；虮磉_分析顯示Sl AREB1能夠上調與高鹽、干旱和氧化應激相關(guān)基因的表達。
一些DREB/CBF基因在A(yíng)BA獨立的干旱響應過(guò)程中起重要作用, 并且通過(guò)分離和鑒定該家族的很多成員發(fā)現, 它們能夠改良植物的抗旱性。首先在擬南芥中發(fā)現DREB (包括兩個(gè)亞類(lèi):DREB1和DREB2) 在干旱脅迫中起作用 (Liu et al., 1998) 。將擬南芥的At CBF1轉錄因子在rd29A啟動(dòng)子的控制下, 在番茄中異源表達, 能夠顯著(zhù)提高轉基因番茄植株對干旱脅迫的耐受性, 并且植株正常生長(cháng) (Singh et al., 2011) 。然而Li等 (2012) 研究發(fā)現, 當SIDREB基因在番茄中超量表達時(shí), 由于合成赤霉素的關(guān)鍵基因下調表達, 導致轉基因番茄葉片擴大和節間伸長(cháng)受到限制, 從而造成矮小的表型, 由此提高了轉基因番茄的抗旱性。
NAC由NAM、ATAF和CUC組成, 屬于植物特有的TF家族, 番茄中共有102條NAC蛋白, 這個(gè)家族的部分基因參與植株對病原體、病毒感染和環(huán)境刺激的反應 (Souer et al., 1996;Nuruzzaman et al., 2013) 。Liu等 (2014) 研究發(fā)現, 將NAC轉錄因子Sl SRN1沉默能夠增加轉基因番茄對生物脅迫的敏感性, 如因灰葡萄孢菌、丁香假單胞菌而感染疾病, 但會(huì )提高轉基因番茄對氧化、高鹽、干旱脅迫的耐受性。Sl NAC4調控干旱和高鹽的相關(guān)基因表達, 在番茄抗旱過(guò)程中起著(zhù)很重要的作用 (Zhu et al., 2014) 。由此, NAC蛋白可以作為功能基因資源, 用于改善植物對生物和非生物脅迫的耐受性 (Nakashima et al., 2012;Puranik et al., 2012) 。
其他轉錄因子, 如乙烯響應因子 (ERF) 不僅能夠促進(jìn)植物種子萌發(fā)、果實(shí)成熟、器官脫落、病原體反應和衰老, 還能夠參與植物脅迫反應 (Narayana, 1991) ;并且其他研究還證明, ERF的TF家族參與植物脅迫反應 (Lorenzo et al., 2003) 。Klay等 (2014) 研究發(fā)現, 屬于番茄ERF家族的轉錄因子Sl-ERF.B.3基因在干旱以及鹽分脅迫下被下調表達, 但有趣的是低溫、高溫脅迫會(huì )誘導其表達。超量表達1個(gè)番茄的WRKY轉錄因子Sl WRKY39, 顯著(zhù)提高了番茄的抗旱能力 (Sun et al., 2015) 。番茄的1個(gè)SR/CAMTA轉錄因子Sl SR1和Sl SR3L負向調控番茄的抗病能力, 但是正向調控番茄的抗旱性 (Li et al., 2014a) 。
2.1.2 氧化調控相關(guān)基因
活性氧 (ROS) 會(huì )導致脂質(zhì)過(guò)氧化、蛋白質(zhì)和核酸的變性等, 可通過(guò)抑制ROS積累以減輕干旱脅迫, ROS的清除是由一系列酶和非酶抗氧化劑以及有機化合物完成的 (Gill&Tuteja, 2010) 。
過(guò)氧化氫酶 (CAT) 是一種抗氧化酶, 屬于ROS清除劑, 負責將H2O2分解成水和氧氣, 以維持植株體內活性氧的平衡。將源自大腸桿菌的過(guò)氧化氫酶 (cat E) 基因引入番茄的葉綠體后, 轉基因株系對過(guò)氧化氫具有更高的親和性, 并且轉基因番茄中cat E基因過(guò)表達不僅能夠提高因冷脅迫或干旱脅迫而引起的氧化損傷的耐受性, 還能夠提高由除草劑百草枯引起的氧化應激的耐受性 (Mohamed et al., 2003) 。
在高等植物中, 超氧化物歧化酶 (SOD) 作為抗氧化酶和ROS的清除劑, 負責催化超氧自由基產(chǎn)生的O2和H2O2。在植物細胞中根據酶的活性位點(diǎn)上具有不同的金屬 (Fe2+、Mn2+和Cu2+) , 以及它們在亞細胞定位中不同的位置 (細胞質(zhì)、線(xiàn)粒體、過(guò)氧化物酶體和葉綠體) , 將其分為幾種SOD異構體 (Wang et al., 2007;Aydin et al., 2014) 。如Mn SOD基因在番茄植株中的過(guò)表達能提高對高鹽和干旱脅迫的抗性, 且降低了電解質(zhì)的滲透率, 這意味著(zhù)Mn SOD能夠降低活性氧對轉基因番茄的損傷 (Wang et al., 2007) 。
葡萄糖-6-磷酸脫氫酶 (G6PDH) 在戊糖磷酸途徑中首先氧化葡萄糖-6-磷酸 (G6P) , 是該反應的限速酶, 并且能夠產(chǎn)生大量的NADPH。G6PDH活性增強能夠為抗氧化系統提供NADPH, 以去除過(guò)量的ROS, 保護細胞膜的穩定性 (Santo et al., 2012) 。G6PDH啟動(dòng)子中具有不同的ABA響應元件, 其表達部分是由于A(yíng)BA的誘導 (Cardi et al., 2011) 。G6PDH在干旱條件下與ABA合成相關(guān)的NCED, ABA信號轉導因子PP2C, 參與脯氨酸合成的P5CS, 參與ROS清除的抗壞血酸過(guò)氧化物酶 (APX) 等其他干旱相關(guān)基因均在番茄的應激反應中呈現顯著(zhù)上調和活性增強, 并且在干旱條件下呈現持續增長(cháng)的狀態(tài) (Landi et al., 2016) 。綜上所述, 干旱誘導ABA合成和信號傳導, 特異性激活ABA應答基因, G6PDH則被特異地誘導, 以此滿(mǎn)足清除系統 (例如APX) 增加引起的增加還原劑的需求, 從而調節和穩定ROS的增量, 進(jìn)而提高了植物的抗旱性 (Landi et al., 2016) 。
2.1.3 信號傳導相關(guān)基因
當細胞壁首先感知非生物脅迫后會(huì )激活涉及不同脅迫基因的信號轉導 (Oliveira et al., 2014) 。轉錄后蛋白修飾如蛋白磷酸化/去磷酸化, 蛋白降解/修飾和第二信使的感應如Ca2+, 它們在脅迫信號傳導和調節中發(fā)揮重要作用。一些TF和干旱響應蛋白需要通過(guò)被磷酸化/去磷酸化或修飾等翻譯后調節以獲得活性, 例如編碼絲裂原活化蛋白激酶 (MAPK) 、編碼CIPK蛋白激酶的基因、編碼鈣依賴(lài)蛋白激酶 (CDPK或CPK) 和編碼蔗糖非酵解型蛋白激酶鈣依賴(lài)蛋白激酶 (Sn RK) 等的基因都在干旱脅迫信號傳導和調節途徑中起作用。MAPK在耐受脅迫相關(guān)的信號網(wǎng)絡(luò )中起關(guān)鍵作用 (Huang et al., 2012) 。將植物暴露于各種非生物脅迫條件下時(shí), MAPK參與ABA的調節過(guò)程 (Hirayama&Shinozaki, 2007) , Li等 (2013) 使用VIGS方法發(fā)現Sp MPK1、Sp MPK2和Sp MPK3基因通過(guò)影響ABA-H2O2途徑影響H2O2的產(chǎn)生和氣孔的運動(dòng)來(lái)增強番茄的耐旱性。超表達Sl MPK7的轉基因番茄會(huì )積累較少的ROS、更多的脯氨酸和可溶性糖以及誘導脅迫響應基因表達, 提高轉基因番茄對非生物脅迫的耐受性 (Yu et al., 2016) 。CIPK和CDPK是兩種類(lèi)型的Ca2+-敏感蛋白激酶, 據報道Md SOS2L1 (源自蘋(píng)果的CIPK激酶) 能夠增加番茄和蘋(píng)果中抗氧化代謝物的水平 (Hu et al., 2016) 。Sn RK是廣泛存在于植物中的一類(lèi)Ser/Thr類(lèi)蛋白激酶, 在植物抗逆生理過(guò)程中具有重要的作用, 例如在番茄中抑制表達Sl Sn RK2.1、Sl Sn RK2.2顯著(zhù)提高了轉基因番茄對滲透脅迫的耐受性以及對氧化脅迫的耐受性, 番茄的耐鹽性和耐旱性明顯增強 (Yang et al., 2015) 。
2.2 番茄抗旱性常規育種的研究進(jìn)展
番茄抗旱性的常規育種主要采用大規�；亟徊呗垣@得集親本優(yōu)良性狀于一體的新品種, 獲得超越親本的雜交后代或者由基因互作產(chǎn)生親本不具備的新性狀類(lèi)型, 開(kāi)發(fā)具有改良抗旱性和具有高產(chǎn)潛力的新品種 (Slabbert et al., 2004) 。許多研究表明, 野生番茄及其近緣野生種中含有豐富的耐旱基因, 將這些攜帶優(yōu)良耐旱基因的野生番茄與普通栽培種番茄雜交, 可以將雙親的優(yōu)良性狀整合到一起, 從而育成耐旱性強的番茄材料或新品種。例如耐旱野生番茄S.pennellii和普通栽培種番茄S.lycopersicum cv.M82進(jìn)行雜交, 雜交后代與M82進(jìn)行回交, 在干旱條件下后代的產(chǎn)量顯著(zhù)高于親本 (Gur&Zamir, 2004) 。
由于常規育種是通過(guò)植株的表型性狀來(lái)推測抗旱性的基因型, 而抗旱性是由多個(gè)小的微效基因座控制, 且遺傳多樣性, 遺傳力低, 抗旱性相關(guān)性狀的基因型-環(huán)境相互作用水平較高, 所以番茄抗旱育種中常規育種的進(jìn)展仍然相當緩慢。隨著(zhù)現代生物技術(shù)的迅速發(fā)展, 人們開(kāi)始利用分子生物學(xué)手段進(jìn)行植物抗旱性分子改良研究。在利用基因工程改良番茄抗旱性的同時(shí), 分子標記輔助選擇 (MAS) 技術(shù)也應用到改良作物抗旱育種實(shí)踐中。采用MAS技術(shù)能夠追蹤調控抗旱性狀的遺傳位點(diǎn), 免去多年的大量田間測試工作, 提高選擇效率, 同時(shí)高分辨率的遺傳圖譜和物理圖譜建成之后, 就可以通過(guò)圖位克隆技術(shù)分離抗旱相關(guān)基因, 研究抗旱基因的功能。同樣, 標記輔助回交 (MABC) 的策略可以將抗旱供體基因型的主要數量性狀基因座 (QTL) 滲入高產(chǎn)但不抗旱或干旱敏感的受體親本中, 以提高植物的抗旱性。
3 展望
番茄營(yíng)養豐富, 風(fēng)味獨特, 深受人們的喜愛(ài)。近年來(lái)我國番茄栽培面積不斷增加, 尤其是設施栽培。但是農業(yè)水資源匱乏是限制番茄生產(chǎn)的重要因素之一, 因此, 科學(xué)合理地進(jìn)行番茄生產(chǎn)是眾多研究人員的目標。
在自然條件下, 干旱脅迫的時(shí)節、強度和持續時(shí)間是高度動(dòng)態(tài)和不可預測的, 這使得抗旱性研究復雜化。因此, 如果條件允許, 在評估抗旱時(shí)應與其他主要的非生物脅迫如高溫和高鹽聯(lián)系起來(lái), 因為干旱脅迫經(jīng)常伴隨高溫脅迫的發(fā)生, 并且植物在響應這些脅迫時(shí)會(huì )在多種水平上發(fā)生交互作用。
通過(guò)轉基因的方法已經(jīng)分離和鑒定了許多與作物抗旱性相關(guān)的基因。然而, 檢測這些基因對番茄抗旱性的影響主要在溫室、小盆中或僅在幼苗期間進(jìn)行, 只有少數在田間檢測。由于田間干旱脅迫的復雜性, 那些溫室中對改良抗旱性有效的基因在用于育種程序之前必須在田間進(jìn)行進(jìn)一步評估。并且一些基因對作物正常生長(cháng)或增產(chǎn)潛力會(huì )有負面影響, 例如植物在遭遇不利的環(huán)境時(shí), 植株變得矮小, 減少能量或水分的流失以適應逆境。所以在番茄抗旱育種過(guò)程中, 在明確基因功能的基礎上, 還需要建立科學(xué)的抗旱評價(jià)體系。目前, 利用現代分子生物學(xué)和MAS結合的方法進(jìn)行育種, 是提高番茄抗旱性的有效途徑。
基因組編輯也是一種精準、高效的基因工程方法。其中CRISPR/Cas (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein) 系統只需合成1個(gè)sg RNA就能實(shí)現對基因的特異性修飾, 操作簡(jiǎn)單。利用此系統將番茄的Sl MAPK3基因進(jìn)行定點(diǎn)敲除, 番茄表現對干旱高度敏感 (Wang et al., 2017) 。盡管關(guān)于基因編輯技術(shù)在番茄抗旱性方面的報道并不多, 但番茄具有高效的轉化方法、二倍體基因組、高質(zhì)量的基因組序列以及極高的經(jīng)濟價(jià)值, 在眾多雙子葉植物中是CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的理想候選者 (Brooks et al., 2014) , 并且基因編輯技術(shù)能夠定向修飾基因, 能夠獲得不含轉基因痕跡的后代, 操作方便。因此基因編輯技術(shù)在改良番茄性狀、提高抗旱性方面極具潛力。
參考文獻
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