白芷質(zhì)量控制按對照提取物定量研究論文
摘要:目的評價(jià)用對照提取物定性和一測多評定量相結合的方法對白芷藥材進(jìn)行質(zhì)量控制。方法用高效液相色譜法，色譜柱:ACEUltraCoreC18(50mm×2.1mm，2.5μm)，流動(dòng)相:乙腈－水梯度洗脫，流速:0.5mLmin－1，柱溫:30℃，檢測波長(cháng):310nm，進(jìn)樣量:5μL�？疾煸摲椒ǖ膶�(zhuān)屬性、標準曲線(xiàn)和定量下限、精密度與回收率、穩定性以及重現性。結果高效液相色譜法對白芷中的5種主要香豆素類(lèi)成分，佛手柑內酯、氧化前胡素、歐前胡素、cinidilin和異歐前胡素進(jìn)行了快速分離，線(xiàn)性關(guān)系良好(r≥0.9994)，回收率較高，均在96.4%～100.0%內。對照提取物能快速對白芷中的5種主要成分進(jìn)行定性。單標定量方法測得成分含量與標準曲線(xiàn)法定量的結果一致。結論對照提取物定性和單標定量相結合的質(zhì)量控制方法是簡(jiǎn)單、可行的，能有效地對白芷藥材進(jìn)行質(zhì)量控制。
關(guān)鍵詞:白芷;質(zhì)量控制;對照提取物;單標定量
白芷為傘形科植物白芷或杭白芷的干燥根，其主要活性成分為香豆素類(lèi)化合物［1］。白芷作為中國傳統中藥，在河北省均有廣泛種植與分布，為河北省道地中藥材。然而由于不同的加工工藝以及不同的來(lái)源，市售的白芷質(zhì)量存在一定的差異，為了保證用藥的安全有效，本研究將對照提取物鑒定和一測多評定量方法有機結合，建立中藥質(zhì)控的方法，并將其應用于河北道地藥材白芷的質(zhì)量控制研究，為中藥對照品缺乏下的中藥質(zhì)量控制提供現實(shí)可行的方案。
材料和方法
1儀器與試藥
佛手柑內酯對照品，規格:每瓶20mg，批號:07111221，上海同田生物技術(shù)有限公司提供;歐前胡素、異歐前胡素、cinidilin和氧化前胡素，河北醫科大學(xué)藥學(xué)院自制，經(jīng)HPLC－DAD分析純度不少于98%;白芷樣品1～6(自然晾干的切片)，采自河北安國;白芷樣品7～10(硫熏樣品)，購自河北石家莊當地藥店。標準白芷香豆素提取物由白芷總提取物經(jīng)大孔樹(shù)脂分離和硅膠柱分離所得。包含了主要的5種香豆素成分:佛手柑內酯、氧化前胡素、歐前胡素、cinidilin和異歐前胡素，其色譜峰面積比例為0.2∶1.9∶1.0∶0.7∶0.8，與其在原藥材中的比例相似。1200高效液相色譜儀，美國Agilent公司產(chǎn)品。
2色譜條件
色譜柱:ACEUltraCoreC18(50mm×2.1mm，2.5μm);流速:0.5mLmin－1;柱溫:30℃;檢測波長(cháng):310nm;流動(dòng)相:乙腈－水梯度洗脫;進(jìn)樣量:5μL。梯度洗脫程序為0～5min，45%～45%乙腈;5～15min，45%～80%乙腈。
3溶液的制備
對照品溶液制備分別稱(chēng)取佛手柑內酯、氧化前胡素、歐前胡素、cinidilin和異歐前胡素對照品適量，用75%甲醇溶解、稀釋配制成質(zhì)量濃度為1.0mgmL－1對照品溶液。供試品溶液制備白芷藥材粉碎，過(guò)3號篩，稱(chēng)取0.5g，置于50mL量瓶中，加入75%甲醇20mL，搖勻，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲提取30min，取出，放冷，用75%甲醇補足質(zhì)量，搖勻，取上清液過(guò)0.45μm微孔濾膜，即得。
4方法學(xué)考察
專(zhuān)屬性分別吸取對照品溶液和供試品溶液5μL，用上述色譜條件進(jìn)行分析，考察待測組分與樣品中其他物質(zhì)的分離情況。標準曲線(xiàn)與定量下限吸取對照品儲備液適量，稀釋成系列濃度，進(jìn)樣并測定峰面積，以對照品溶液的濃度為縱坐標，相應峰面積為橫坐標，繪制標準曲線(xiàn)，進(jìn)行線(xiàn)性回歸。各分析化合物根據各自標準曲線(xiàn)進(jìn)行定量(Method1)。將合適量的對照提取物溶解于75%甲醇中，配制成系列濃度的溶液，按上述方法對其中的主要成分歐前胡素進(jìn)行線(xiàn)性回歸，用得到的標準曲線(xiàn)對5種香豆素類(lèi)成分進(jìn)行定量計算(Method2)。將混合對照品溶液逐步稀釋并進(jìn)行測定，以信噪比S/N≥3時(shí)確定為檢測限，以信噪比S/N≥10時(shí)確定為定量限。精密度與回收率配制低、中、高3種不同的濃度，日內精密度是在同一天內對同一份樣品連續測定6次，日間精密度則是在連續3d內對同一份樣品進(jìn)行測定，通過(guò)計算相對標準偏差來(lái)實(shí)現。取含量已知的白芷樣品0.25g，分別加入一定濃度的對照品溶液，按“供試品溶液制備”項下方法制備供試品溶液，重復進(jìn)樣，測定樣品溶液中有效成分的含量并計算平均回收率。穩定性取白芷藥材粉碎，按“供試品溶液制備”項下方法制備供試品溶液，分別于0，4，8，12，24h取供試品溶液進(jìn)樣測定峰面積。同時(shí)考察對照提取物溶液放置24h的穩定性。
結果
1方法學(xué)評價(jià)
專(zhuān)屬性在上述色譜條件下，待測成分各色譜峰與其他成分分離良好，其他成分不干擾待測成分的'測定。典型色譜圖見(jiàn)圖1。標準曲線(xiàn)與定量下限5種成分的線(xiàn)性關(guān)系方程和線(xiàn)性范圍見(jiàn)表1，相關(guān)系數r≥0.9994，表明在線(xiàn)性范圍內，線(xiàn)性關(guān)系良好。精密度與回收率5個(gè)分析物的日內、日間變異分別小于1.3%和2.3%，回收率均大于96.4%，重復性良好(ＲSD≤1.3%)。結果見(jiàn)表2。穩定性樣品及對照提取物在室溫下放置24h是穩定的。結果見(jiàn)表2。
2方法學(xué)應用
按“供試品溶液制備”方法制備10個(gè)批次白芷供品溶液，按色譜條件進(jìn)樣分析，測定5個(gè)成分的峰面積值。通過(guò)標準曲線(xiàn)法和單標定量法對白芷樣品中的5種測定成分含量進(jìn)行了計算，結果見(jiàn)表3。為了評價(jià)單標定量的可行性(以歐前胡素為內參，對其余4種成分進(jìn)行定量估算)，用不同百分數(PD)和向量余弦相似度［Cos()］對兩種方法得計算結果進(jìn)行了評估。PD%=100×|X－Y|X+Y2，Cos()=∑ni=1XiYi∑ni(Xi)2∑ni(Yi)槡2其中，X，Y分別代表由標準曲線(xiàn)法和單標定量法計算所得成分含量，n代表樣品個(gè)數�？芍�，5種成分的平均PD均小于5%，兩種方法計算所得濃度具有一定的一致性。所有測定向量得Cos()＞0.9999，表明兩種方法具有較高的相似度。
討論
藥典規定白芷含量測定的質(zhì)量控制成分為歐前胡素，且該成分在白芷中含量較高，對照品易得，故選擇歐前胡素為內參物。本實(shí)驗結果表明，用單標定量法所測得白芷中5種香豆素類(lèi)成分含量與標準曲線(xiàn)法所測得的含量無(wú)明顯差異，說(shuō)明在缺少對照品的情況下可以通過(guò)測定白芷中一種香豆素的含量來(lái)計算其他4種同類(lèi)成分含量，進(jìn)而更全面地評價(jià)藥材質(zhì)量，實(shí)現一測多評。樣品測定結果表明，河北道地白芷藥材中氧化前胡素含量最高，5種主要香豆素類(lèi)活性成分含量基本符合氧化前胡素﹥歐前胡素﹥異歐前胡素﹥cinidilin﹥佛手柑內酯的順序。熏硫后(樣品7－10)多種香豆素類(lèi)成分的含量有較大損失，此前也有文獻報道此類(lèi)現象［2－3］，可見(jiàn)熏硫是白芷樣中香豆素類(lèi)成分含量下降的主要因素。中藥成分復雜，多成分、多指標的質(zhì)量控制模式得到越來(lái)越多的認可和應用。然而，多指標定量的中藥質(zhì)量控制模式需要足夠量的具有足夠高純度的對照品，這已成為制約中藥質(zhì)量控制的一個(gè)瓶頸�！吨袊幍洹�2010年版提出一測多評的分析方法［4－5］，該方法實(shí)現了中藥多成分定量，解決了中藥化學(xué)對照品匱乏的瓶頸問(wèn)題。然而，一測多評在實(shí)際應用于定量測定時(shí)，由于只有內參物用到了對照品，其他待測成分無(wú)對照品，無(wú)法準確地確定待測組分峰(即目標峰)的位置。針對此問(wèn)題，《中國藥典》2005年版引入了對照提取物，將其作為標準物質(zhì)收載。對照提取物不但具有相對固定的定的化學(xué)組成，含有定量指標的主要效應成分，與原藥材量化關(guān)系明確，專(zhuān)屬性強，而且具有安全、穩定的理化特性，尤其適用于中藥的鑒別。對照提取物鑒定和一測多評定量相結合將有助于更加有效地對藥材質(zhì)量進(jìn)行控制。
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