植物基因工程課件
下面是小編搜集整理的植物基因工程課件，希望對大家有幫助！
植物基因工程課件
�。�1）植物基因轉化受體系統的條件
�。�2）植物基因轉化受體系統的類(lèi)型和特性。
�。�3）植物基因工程載體的種類(lèi)和特性
�。�4）根癌農桿菌Ti質(zhì)粒的結構與功能：T-DNA、Vir區操縱子的基因結構與功能。
�。�5）農桿菌Ti質(zhì)�；蜣D化機理
�。�6）農桿菌Ti質(zhì)粒的改造及載體構建
�。�7）載體構建中常用的選擇標記及報告基因
�。�8）根癌農桿菌的轉化程序及操作原理
�。�9）外源基因在植物中的表達
了解植物基因轉化受體系統的類(lèi)型、特性掌握Ti質(zhì)粒的結構與功能，植物載體構建原理，植物基因工程常用的載體類(lèi)型。
重點(diǎn)
根癌農桿菌Ti質(zhì)粒介導的基因轉化的原理和方法
難點(diǎn)
植物載體構建原理
關(guān)鍵點(diǎn)
轉基因植物的獲取和檢測
教學(xué)目的和要求
教材分析
主要教具和設備材料
投影儀、電腦、常規教學(xué)設備板書(shū)與多媒體授課相結合
教法 思考題
1. 植物基因工程載體種類(lèi)？
2. 根癌農桿菌轉化程序？
心得
在自然界的許多雙子葉植物中，常常發(fā)生一種嚴重危害植物生長(cháng)的病害——冠癭。已知90多科，600多種雙子葉植物都能感染這種病。一般認為單子葉植物和裸子植物對此病不敏感。70年代中期，世界上幾個(gè)實(shí)驗室發(fā)現誘發(fā)腫瘤的根癌農桿菌中含有大量的誘瘤質(zhì)粒Ti(tumor-inducing plasmid),且證實(shí)了腫瘤的形成正是由于pTi中的特定片段——T-DNA轉移并穩定地整合進(jìn)植物細胞核基因組中的結果；由于其上載著(zhù)的冠癭堿合成基因和激素合成基因表達，因此分泌冠癭堿并形成腫瘤。人們就把這種冠癭的形成過(guò)程稱(chēng)作天然的植物細胞轉化系統。
農桿菌將自身的DNA插入植物細胞誘發(fā)腫瘤只對其本身是有益的，重要原因之一是因為農桿菌誘發(fā)植物細胞合成冠癭堿為自己提供食物。植物自身不能利用這種物質(zhì)，只能為它的合成付出代價(jià)，別的細菌也不能利用它，在自然條件下，只有農桿菌能分泌分解冠癭堿的酶，將這些特異產(chǎn)物作為唯一的碳源和氮源來(lái)利用。
腫瘤的產(chǎn)生是由于T-DNA上的激素合成基因所致，刺激細胞生長(cháng)而產(chǎn)生腫瘤，這是T-DNA轉入的一個(gè)副產(chǎn)品。
Ti質(zhì)粒給自己設計出一套為其自身存活的非常優(yōu)秀的進(jìn)化格局：它感染植物細胞，使之出現愈傷組織增生，后者便產(chǎn)生出供帶有Ti質(zhì)粒的細菌用作能源、碳源和氮源的冠癭堿；而冠癭堿的產(chǎn)生又可激發(fā)Ti質(zhì)粒轉移到原先沒(méi)有存在這種質(zhì)粒的土壤農桿菌中去，如此周而復始得到不斷發(fā)展。
Ti質(zhì)粒是一類(lèi)理想的植物基因工程載體，通過(guò)它們可以將外源DNA轉移到植物細胞，并再生出能夠表達外源基因的轉基因植物。 Ti質(zhì)粒還具有若干其他載體所不具備的優(yōu)點(diǎn)：
�。�1）T-DNA能夠進(jìn)行高頻的轉移，而且這種轉移的DNA通常是以未發(fā)生變化的完整形式整合到植物的核基因組上。
�。�2）Ti質(zhì)粒不存在包裝限制問(wèn)題，大到50kb的外源DNA也能順利地包裝與轉移。
一、植物基因工程載體種類(lèi)
據載體的功能和構建過(guò)程，可把有關(guān)載體分為四大類(lèi)型（九種載體）。 克隆載體、中間載體、卸甲載體、轉化載體
據載體的功能和構建過(guò)程，可把有關(guān)載體分為四大類(lèi)型，九種載體。
1、克隆載體（目的基因的克隆載體）
通常由多拷貝的E.coli小質(zhì)粒為載體 功能：保存和克隆目的基因。
2、中間載體又分為中間克隆載體和中間表達載體。
中間克隆載體：由大腸桿菌質(zhì)粒插入T-DN段及目的基因、標記基因等構建而成。
功能：構建中間表達載體的基礎。
分為：中間粘粒載體、質(zhì)粒粘粒愈合載體、基因標記載體。 中間表達載體：含有植物特異啟動(dòng)子的中間載體
功能：作為構建轉化載體的質(zhì)粒。
3、卸甲載體
解除武裝的Ti質(zhì)�；騌i質(zhì)粒。（onc+ -------- onc-） 功能：作為轉化載體的受體質(zhì)粒
4、轉化載體
最后用于目的基因導入植物細胞的載體，亦稱(chēng)工程載體。 它是由中間表達載體和卸甲載體構建而成。
分為一元載體系統（順式載體）和雙元轉化載體系統（反式載體）。 一元載體系統包括共整合載體和拼接末端載體（SEV）。
二、根癌農桿菌Ti質(zhì)粒
1、Ti質(zhì)粒的類(lèi)型、結構與功能
�。�1）類(lèi)型
Ti質(zhì)粒是根癌農桿菌染色體以外的遺傳物質(zhì)，為雙股共價(jià)閉合的環(huán)狀DNA分子，分子量為95~156 x 106D，約150 ~ 200 Kb長(cháng)。根據其誘導的冠癭堿種類(lèi)不同，Ti質(zhì)�？煞譃槿�(lèi)： 章魚(yú)堿型（octopine）：pTiAch5, pTiA6NC, pTiB653, pTiAg162 胭脂堿型（nopaline）：pTiT37, pTiT38, pTiC58
農桿堿型（agropine）和農桿堿素型（agrocinopine）或琥珀堿型（succinamopine）
�。�2）結構和功能
各種Ti質(zhì)粒都可分為四個(gè)區：
�、賂-DNA區（transferred-DNA regions）：是農桿菌侵染植物細胞時(shí)，從Ti質(zhì)粒上切割下來(lái)轉移到植物細胞的一段DNA。該DN段上的基因與腫瘤的形成有關(guān)。
�、赩ir區（Virulence region）：該區段上的基因能激活T-DNA轉移，使農桿菌表現出毒性，故稱(chēng)之為毒性區。T-DNA區與vir區在質(zhì)粒上彼此相鄰，合起來(lái)約占Ti質(zhì)粒DNA的1/3。
�、跜on區（region of replication）：質(zhì)粒結合轉移位點(diǎn)編碼區，該區段上存在著(zhù)與細菌間接合轉移的有關(guān)基因（tra），調控Ti質(zhì)粒在農桿菌之間的轉移。冠癭堿能激活tra基因，誘導Ti質(zhì)粒轉移，因此，稱(chēng)之為接合轉移編碼區。
�、躉ri區（origin of replication）：該區段基因調控Ti質(zhì)粒的自我復制，稱(chēng)之為復制起始區。
3種成分與Ti質(zhì)粒腫瘤誘導有關(guān):
T-DNA：它可轉移至宿主細胞，是一種可移動(dòng)因子。
毒性區：vir基因可產(chǎn)生轉移活動(dòng)蛋白，對增強植物細胞的轉化是必須的。 土壤農癌桿菌染色體基因:間接參與轉化，負責將細菌細胞接合于植物上。
2、T-DNA的基因結構和功能
�。�1）T-DNA的結構特點(diǎn) 長(cháng)約23Kb
在T-DNA的5’和3’端都有真核表達信號，如TATAbox，AATAAbox及polyA等。
T-DNA的兩端左右邊界各為25bp的重復序列，即邊界序列，分別稱(chēng)之為左邊界（BL或TL）和右邊界（BR或TR）。該25bp邊界序列屬保守序列（TGACACGATATAT TGGCGGGTAAAC）。通常右邊界序列更為保守，左邊界在某些情況下有所變化。左邊界的缺失突變仍能致瘤，但右邊界缺失則不致瘤，這時(shí)幾乎完全沒(méi)有T-DNA的轉移，這說(shuō)明右邊界在T-DNA的轉移中的重要性。
胭脂堿型腫瘤，為一連續的一段序列，長(cháng)約23.4Kb，有腫瘤系，僅一個(gè)拷貝，有的T-DNA是多拷貝的。
章魚(yú)堿型腫瘤：T-DNA分左右兩部分（TL-DNA和TR-DNA），各自帶有左右邊界序列。左區的順序變化不大，長(cháng)度約13Kb，通常一個(gè)拷貝，但也有幾個(gè)拷貝首尾相連排列。含章魚(yú)堿合成酶基因和致瘤基因。TR-DNA較短，長(cháng)約6-7Kb，拷貝數達數個(gè) 或數十個(gè)，有的腫瘤系中沒(méi)有TR-DNA。TR-DNA編碼5個(gè)基因，如甘露堿和冠癭堿合成酶基因。
�。�2）T-DNA上的編碼基因及功能
章魚(yú)堿型和胭脂堿型T-DNA的轉錄有下述共同特點(diǎn)： T-DNA的兩條鏈都是有意義鏈；
T-DNA上每個(gè)基因都有各自的啟動(dòng)子； 基因的轉錄由植物細胞RNA聚合酶II完成；
T-DNA具典型的真核生物RNA合成起始和終止的調節信號，在其5’端轉錄起始處有TATA和CAAT盒。另外，至少在5個(gè)T-DNA基因中發(fā)現有一個(gè)8bp的相同順序（TTTCAA GA），同時(shí)AATAAA加尾信號也在同一條鏈上發(fā)現。
植物或農桿菌中可能有甲基化或去甲基化的調節基因活性。 3、Vir區操縱子的基因結構與功能
毒性區的大多數基因產(chǎn)物都控制T-DNA的轉移，這個(gè)區域的突變往往導致農桿菌感染植物能力的下降。
�。�1）Vir區操縱子的基因結構
章魚(yú)堿型Ti質(zhì)粒：Vir區大小為40kb，含有VirA、B、C、D、E、F、G、H（PinF）等8個(gè)操縱子，共24個(gè)基因。大多數操縱子含有多個(gè)基因VirA（1）、VirB（11）、VirC（2）、VirD（4）VirE（2）、VirF（1）、VirH（2）。
胭脂堿型Ti：有7個(gè)操縱子，少一個(gè)VirF，它們的第一個(gè)操縱子也不同，章魚(yú)堿型Ti是VirH，而胭脂堿型Ti是Tzs，其功能也不同。 Vir區基因的表達有兩種方式：
組成型表達；在無(wú)植物誘導分子存在下依然保持一定的表達水平，virA，virG、virH 誘導型表達：這些基因的表達必須在土壤農桿菌感染植物時(shí)，在植物受傷組織分泌的信號分子作用下才能啟動(dòng)表達，如virB、C、D、E
virG雖屬于組成型表達，但有植物信號分子存在下表達量提高10倍，也具誘導表達特性。
�。�2）Vir區操縱子的基因的功能
�、賄ir A 單個(gè)基因，2.4kb，僅編碼一條多肽。Vir A編碼一種結合在膜上的化學(xué)受體蛋白（92KD），可直接對植物產(chǎn)生的酚類(lèi)化合物感應，是一種感應蛋白。
Vir A的活化：當AS與Vir A的受體部分結合后，會(huì )使整個(gè)Vir A蛋白構象發(fā)生變化，其C端活化。Vir A蛋白的胞質(zhì)區有自激酶的功能，可在保守的組氨酸殘基上磷酸化，從而Vir A蛋白被激活。激活后的Vir A具有轉移其磷酸基至Vir G蛋白的一個(gè)宿存的天冬氨酸殘基的能力，使Vir G蛋白激活。
�、赩ir G Vir G ，只有1Kb，單基因，編碼DNA結合蛋白,其C端有DNA結合活性，N端具有磷酸化的酸性結構。
從總體效應講，Vir G基因是屬于組成型表達的，這對于細菌迅速地將外部環(huán)境信號傳遞到細胞內十分有利。
當磷酸化的A蛋白將其磷酸基轉到Vir G保守的天冬氨酸殘基上時(shí)，使Vir G蛋白活化，活化Vir G蛋白可以二體或多體形式結合到Vir啟動(dòng)子的特定區，從而成為其它Vir 基因轉錄的激活因 子，打開(kāi)Vir B、C、D、E、H等幾個(gè)基因。Vir A或G突變后會(huì )減弱或完全失去對其他Vir 位點(diǎn)活化的誘導，VirA及 Vir G 的這種調控作用被稱(chēng)為雙因子調控體系。 ?Vir H、Vir F及Tzs
這些基因對質(zhì)粒是特異的，在章魚(yú)堿型中有Vir F、Vir H，在胭脂堿型中有Tzs。
Vir H：對植物產(chǎn)生的某些殺菌或抑菌化合物起解毒作用，從而使自身生不受抑制，可增強致瘤能力。
Vir F：編碼一個(gè)23KD蛋白，通過(guò)Vir 系統傳遞到植物細胞中，對T-DNA起運輸作用。
Tzs：大部分胭脂堿型菌株的Ti質(zhì)粒上均有Tzs基因，轉運玉米素合成酶基因，在細菌中表達后將玉米素分泌到細胞外。該細胞分裂素被植物吸收后，能促進(jìn)農桿菌感染部位的植物組織脫分化和細胞分裂，提高植物對農桿菌轉化的感受性。
三、農桿菌Ti質(zhì)�；蜣D化機理
1. T-DNA的加工及轉移
首先在下鏈25bp重復序列的右邊界左起第3和第4堿基間剪切，從缺口的3’端開(kāi)始合成新的DNA鏈，并一直延伸到左邊界第22bp處。置換出原來(lái)的下鏈，形成ssDNA，即T鏈。
VirD蛋白的功能：VirD1及 VirD2分別編碼16KD和47KD蛋白，與T-DNA的加工有關(guān)，決定在邊界重復序列的特定位點(diǎn)上形成切口，產(chǎn)生T鏈斷裂。 VirD2蛋白的功能：①特異剪切，并與T鏈的5’端共價(jià)結合。②導向功能；
2.T鏈蛋白復合體的形成及VirE的功能
T鏈必須橫向跨越細菌細胞膜、細菌細胞壁、植物細胞壁、植物細胞膜及核膜才能整合進(jìn)植物基因組。
T鏈以一種DNA-蛋白復合體（T復合體）的形式存在。
目前已知至少兩種Vir特異蛋白即VirE2和VirD2與T鏈蛋白復合體的形成有關(guān)。
VirE2的功能：編碼ssDNA結合蛋白，該蛋白可非特異地一與任何ssDNA結合，通過(guò)與T鏈非共價(jià)結合，VirE2可包被T鏈形成細長(cháng)的核-蛋白絲，使ssDNA抗3’和5’外切核酸酶和內切核酸酶。
3、T鏈復合體通過(guò)細菌細胞膜的轉運及VirB的功能
�。�1）VirB的功能
VirB啟動(dòng)子有11個(gè)基因，大多數編碼跨膜蛋白或膜結合蛋白，能在膜上形成一種類(lèi)似細菌接合轉移時(shí)從供體菌轉至受體菌所必須的結構——接合孔或性毛。T-DNA通過(guò)這種孔由細菌進(jìn)入植物細胞。同時(shí)，VirB也可能起運輸和提供能量的作用。 按功能，可將VirB蛋白分成五類(lèi)：
R：在內膜上或內膜內的某些蛋白，可能作為T(mén)復合體的受體；
A：此類(lèi)蛋白可能作為能源，作為一種ATP酶促進(jìn)T復合體被泵出細菌細胞，VirB11可能是這種A類(lèi)蛋白。
C：形成通道的作用，如：VirB4是一種富集蛋白，無(wú)疏水區，無(wú)信號肽，可能在T鏈轉運中起一種結構作用，形成至少一部分特殊的通道結構。
S：載體蛋白，起運載T 復合體穿過(guò)通道的作用，這類(lèi)蛋白可能與所有膜成分（內膜、外膜及周膜）有關(guān)。
P：位于外膜上，可能作為結合植物細胞膜的一種受體。
�。�2）T復合體向植物細胞核的轉運
VirD2可能以一種極性方向，將T復合體定向至核孔，而VirE2則作為一種促進(jìn)因子，保證很長(cháng)的T復合體在進(jìn)入核孔時(shí)不受干擾。 在T-DNA轉移過(guò)程中，VirD2具有火車(chē)頭的作用，牽制T復合體以5’端到3’端的方向向核遷移，而VirE2則只助推器的角色，幫助未折疊的長(cháng)形T復合物不被打斷，并方便其向核運動(dòng)。 已知VirE2-ssDNA可以抗拒內切酶的作用，如核酸外切酶VII對VirE2-ssDNA降解能力將相當于對ssDNA的6%，對S1核酸酶的效果也相似。
4、細菌染色體上與T-DNA轉移有關(guān)的基因
目前已知農桿菌染色體上有10個(gè)基因與T-DNA轉移有關(guān)，它們主要涉及細菌與植物細胞的接觸和細菌向植物傷口的趨化性。
chvE——編碼一個(gè)葡萄糖和半乳糖結合蛋白，主要結合組成植物細胞壁的單糖；可能由于識別植物受傷產(chǎn)生的糖單體，導致細菌向植物傷口的趨化性；在低pH值、磷酸饑餓條件下啟動(dòng)VirG表達。
chvD——編碼一種細菌ATP結合蛋白，在低pH值、磷酸饑餓條件下誘導VirG蛋白含量升高，然后VirA接受AS信號，刺激VirG轉化成活性形式，啟動(dòng)其他VirG 基因表達。
chvA 、chvB、 chvC——與環(huán)狀?-1，2-葡聚糖的合成和運輸有關(guān)； chvB產(chǎn)物催化合成葡聚糖， chvA產(chǎn)物將多糖從胞質(zhì)運到胞外，影響農桿菌對植物細胞的附著(zhù)能力。
pscA和Exoc——與多糖的合成有關(guān)，并影響農桿菌對植物細胞的附著(zhù)能力。
四、農桿菌Ti質(zhì)粒的改造及載體構建
1、野生型Ti質(zhì)粒直接作為基因工程載體的障礙：
�。�1）分子量大，160~240Kb；
�。�2）有各種限制性?xún)惹忻傅亩鄠�(gè)切點(diǎn)；
�。�3）T-DNA區中含有許多編碼基因與基因轉移無(wú)關(guān)，如致瘤基因，其存在還會(huì )導致植物體喪失形態(tài)發(fā)生能力；
�。�4）Ti質(zhì)粒不能在大腸桿菌中復制。
2、Ti質(zhì)粒構建的幾個(gè)重要因素
�。�1）右邊界序列；
�。�2）完整的Vir基因群；
�。�3）有獨特的酶切點(diǎn)；
�。�4）有在植物中可表達的選擇性基因；
�。�5）有在細菌中可表達的選擇性基因；
�。�6）章魚(yú)堿型農桿菌品系需要獨特的增強子。
3、載體構建
先將T-DN段克隆到大腸桿菌質(zhì)粒中，并插入外源基因，最后通過(guò)三親交配或接合轉
移把外源基因引入農桿菌Ti質(zhì)粒上。
Ti質(zhì)粒的載體系統分兩類(lèi)：一元載體和雙元載體
例：雙元載體的構建
雙元載體系統由兩個(gè)分別含T-DNA和Vir區的相容質(zhì)粒構成。
�。�1）構建原理
Ti質(zhì)粒上的Vir基因可以反式激活T-DNA的轉移，T-DNA和Vir區處于不同的Ti質(zhì)粒上同樣能起到轉移T-DNA的作用。
雙元載體含有廣泛寄主范圍質(zhì)粒的復制起點(diǎn)（oriv），從而代替了在共整合載體中用以重組的同源區，它們能在任何農桿菌寄主里自發(fā)復制。所以寄主僅需一套完整的vir質(zhì)粒就可。主要的轉移區載在小重組Ti質(zhì)粒上。
�。�2）微型Ti質(zhì)粒（mini-Ti plasmid）
含有T-DNA邊界，缺失Vir基因的質(zhì)粒；含廣譜質(zhì)粒的復制位點(diǎn)OriV及選擇標記基因。
�。�3）輔助Ｔｉ質(zhì)粒
含Vir區段的Ti質(zhì)粒，helper Ti,是T-DNA缺失的突變型Ti（卸甲Ti），提供Vir基因功能，反式激活T-DNA的轉移。
LBA4404中含有pAL4404(pTiAch5的衍生質(zhì)粒)，野生型Ti也可做Helper Ti,有更強的毒性。
五、根癌農桿菌侵染植物細胞的機理
1、根癌農桿菌的生物學(xué)特性
分類(lèi)
農桿菌屬，也稱(chēng)土壤桿菌屬和根瘤菌屬，是同屬于根瘤科的革蘭氏陰性菌。
土壤桿菌屬有4 個(gè)種：根癌農桿菌、放射形農桿菌、毛根農桿菌和懸鉤子農桿菌。
根癌農桿菌，根據其誘導植物細胞產(chǎn)生的冠癭堿種類(lèi)不同可分為三種類(lèi)型即章魚(yú)堿型、胭脂堿型和農桿堿型。
生活習性
土壤桿菌屬都是土壤習居菌，主要生活在曾被多種植物生活過(guò)的土壤中，好氧，但也能在低氧壓的植物組織中生長(cháng)，最適溫25~30℃，pH4.0~12.0,最適pH6.0~9.0。 形態(tài)結構
農桿菌細胞呈桿形，0.8x1.5~3.0μm,以1~4根周生鞭毛運動(dòng)，不形成芽孢，菌落無(wú)色，隨菌齡增加，光滑的菌落逐漸變成有條紋，但也有許多菌株生成的菌落呈粗糙型。 寄主范圍
根癌農桿菌廣泛存在于雙子葉植物中，根據不完全統計，約有93屬643種雙子葉植物對根癌農桿菌敏感。裸子植物對該菌同樣具敏感性，能誘發(fā)腫瘤，對絕大多數單子葉植物無(wú)侵染能力。
2、根癌農桿菌侵染的誘導信號及作用機理
�。�1）酚類(lèi)化合物
酚類(lèi)物質(zhì)——農桿菌浸染植物細胞所必需的誘導物，同時(shí)將其作為趨化物來(lái)識別。 實(shí)驗證明，一些植物中常見(jiàn)的酚類(lèi)化合物的混合物都可激活Vir區基因。如：兒茶酚、沒(méi)食子酸、焦性沒(méi)食子酸、β-羥基苯甲酸、原兒茶酸、香草醛。
Stachel等在煙草葉片的傷口誘出液中確認了兩種主要的Vir區基因誘導物：乙酰丁香酮AS和羥基乙酰丁香酮OH-AS。AS效果最好，0.5~1.0μmol/L即可誘導Vir活化。
�。�2）中性糖和酸性糖
中性糖在Vir基因誘導和致病毒力中也起重要作用。Shimoda等人，在限定AS誘導條件下，
發(fā)現許多中性糖（L-阿拉伯糖、D-木糖、D-葡萄糖、D-甘露糖、D-艾杜糖、D-半乳糖、D-塔羅糖、2-脫氧-D-葡萄糖）都可增強一些Vir區基因的誘導。這些中性糖是通過(guò)chvE和VirA起作用，chvE編碼葡萄糖和半乳糖結合蛋白，識別傷口產(chǎn)生的糖單體，導致農桿菌的趨化作用。
酸性多糖是組成植物細胞壁中果膠質(zhì)的主要成分。最近的實(shí)驗證明，酸性糖（胡蘿卜根提取物中蒸餾出來(lái)）可改變農桿菌基因的表達。蛋白質(zhì)標記實(shí)驗表明，至少有10種蛋白質(zhì)合成被其誘導，一種被阻遏。
�。�3）pH值
5.0~5.5的低pH值。誘導物對pH的要求是<.6.0, 在農桿菌培養在含有酚類(lèi)化合物（AS）的培養基中時(shí)，pH5.0 ~5.8Vir的誘導達到一個(gè)最高水平
3、根癌農桿菌的侵染能力及其特異性
�。�1）常用的根癌農桿菌
胭脂堿型（Nop）菌株：染色體背景為C58，生長(cháng)快，不結球，轉化中容易操作，常用的菌株有C58、pGV3850、A208SE等。
章魚(yú)堿型（Oct）菌株：染色體背景為Ach5，生長(cháng)慢，結球，轉化中難操作，培養后不易洗掉，常用的菌株有LBA4404,LBA1010,GV2260,GV3111SE,K61等。
農桿堿型（Agr）菌株，也稱(chēng)琥珀堿型（Suc）：染色體背景為A281或A136，具有胭脂堿型菌株的特點(diǎn)，以A136為染色體背景的常用菌株是EHA101，生長(cháng)快，不結球，侵染能力強，常用的菌株有A281、EHA101、EHA105等。
�。�2）、根癌農桿菌的侵染能力差異
根據侵染能力大小將農桿菌分為：
廣宿主菌株：大多數雙子葉、若干裸子植物、少量單子葉植物；如：pTiB0542、pTiA6； 窄宿主菌株：有限的幾種植物上誘發(fā)腫瘤，如pTiAg162,僅能在葡萄的幾個(gè)品種上誘發(fā)腫瘤。 不同植物對農桿菌侵染的敏感性不同，在轉化中，二者的選配十分重要，要選農桿菌與植物之間有高侵染力的配合。如：楊樹(shù)莖，用C58優(yōu)于LBA4404；蘋(píng)果，6種基因型比較，葉：EHA101（pEHA101）優(yōu)于LBA4404，C58；莖：A281優(yōu)于C58，ACH5，A348。
農桿菌的染色體背景對宿主范圍同樣有著(zhù)重要作用。因為除Vir區功能外，農桿菌對植物表面識別與結合有關(guān)的功能還取決于農桿菌染色體上基因位點(diǎn)。農桿菌所展示出不同的生長(cháng)速率、多糖產(chǎn)生和對植物細胞的毒力都會(huì )影響轉化率和宿主范圍。
六、根癌農桿菌轉化程序及操作原理
1、根癌農桿菌Ti質(zhì)粒轉化的基本程序
�。�1） 選擇適宜的培養基，使創(chuàng )傷部位能產(chǎn)生盡可能多的再生植株。
�。�2） 確定供體植物最適的培養條件。
�。�3） 確定最佳外植體類(lèi)型、大小、部位等：再生途徑，愈傷組織起源（細胞類(lèi)型、層次），
保證轉化愈傷組織和芽原基由創(chuàng )傷部位的淺層細胞發(fā)育而來(lái)。
�。�4） 確定適宜的抗生素水平：抑菌抗生素Cef ，Cb ，能抑制細菌生長(cháng)，還能保證愈傷組
織正常生長(cháng)和分化。
�。�5） 確定選擇壓力的最低水平。
�。�6） 優(yōu)化農桿菌接種和共培養條件改進(jìn)篩選條件，促進(jìn)抗性細胞恢復再生能力：采用無(wú)毒的生化物質(zhì)。
2、根癌農桿菌的培養、純化、保存及工程菌液的制備
�。�1）農桿菌的培養
常用的農桿菌培養基有 LB、 YEM、 YEB、 TY、 523、PA及 MinA等培養基。
這些培養基中，LB、YEB、YEM及523屬富集培養基，其營(yíng)養成分豐富，包括有各種有機成分。在這些培養基中農桿菌生長(cháng)快，分裂旺盛，它們是常用 制備工程菌液的培養基。 ? PA和 TY培養基是屬營(yíng)養較好的培養基，氨基酸及碳源、氮源都很豐富。農桿菌在這些培養基上生長(cháng)也很快，是常用的農桿菌選擇培養時(shí)的培養基。
MinA培養基與前幾種培養基有明顯差異：只提供必要的無(wú)機鹽，并用葡萄糖和（NH4）2SO4 提供碳源和氮源。
Minimal只用相應的冠癭堿如 NOpaline、 Octopine等取代蔗糖、氨基酸和無(wú)機氮作為農桿菌的碳源和氮源。
農桿菌在MinA和Minimal培養基上生長(cháng)較慢。在進(jìn)行三親雜交時(shí)通常用這兩種培養基，并加相應的抗生素選擇轉化的農桿菌。含重組質(zhì)粒的大腸桿菌及含輔助質(zhì)粒 pRK20 13的HB101因不能利用冠癭堿作為碳源和氮源而不能生長(cháng)，同時(shí)還存在抗生素的選擇，因此有利于選擇轉化的農桿菌的生長(cháng)。
農桿菌的生長(cháng)周期
農桿菌培養方式：分為固體平板培養和液體振蕩培養，
固體培養一般需2～3d，液體培養生長(cháng)更快，一般需1～2d。
農桿菌接種在培養液后，并不立即開(kāi)始增殖。一般在25～30℃時(shí)，需1～2 h細菌才開(kāi)始分裂。
當生長(cháng)開(kāi)始后，細菌數目以一恒定的指數速率倍增，直至培養基成分改變和供氧缺乏時(shí)才停止增殖。當細菌增長(cháng)速率達到對數指數時(shí)稱(chēng)之為對數生長(cháng)狀態(tài)。
當細菌密度達到 177／ml時(shí)，空氣中的氧氣便難以很快地擴散到細胞內。在振蕩或通氣條件下培養，細菌濃度也很少超過(guò) 2～3 X 109／ml。
測定農桿菌濃度的方法：最簡(jiǎn)單的方法是光密度測定法。將菌液裝入比色杯汽在分光光度計上選用600nm波長(cháng)測定其OD值。光密度與濃度換算公式是1OD約等于 8 X 108／ml。
�。�2）工程菌的純化
純化菌種的方法主要采用常規的微生物純化方法，即劃線(xiàn)法。用接種針劃線(xiàn)，然后用石蠟膜封口，將平皿倒置放恒溫箱內，在25～28℃條件下培養過(guò)夜，次日或即日看到分離的單菌落。挑取單菌落接種在液體培養基內進(jìn)行液體振蕩培養。
�。�3）工程菌侵染懸浮液的制備
液體振蕩培養的工程菌，通常培養 12～24 h后即可達到對數生長(cháng)期。用離心管取一定數量的菌液進(jìn)行4000r／min離心，倒掉上清液，再加入植物外值體誘導愈傷組織或分芽的液體培養基，使其光密度OD值達到0．5，即可用作接種外植體的工程菌液。
注意：因為農桿菌培養基中通常含有抗生素，它對外植體的生長(cháng)、脫分化或分化有不良影響，放需通過(guò)離心除去細菌培養基，加入植物培養基。也有的做法是，將農桿菌加入植物培養基后再振蕩培養 12 h，當細菌生長(cháng)達到對數生長(cháng)期后再離心，倒掉上清液，用新的植物液體培養基稀釋至一定OD值，再作為工程菌液使用。
�。�4）工程菌的`保存
菌種的保存的目的是創(chuàng )造一個(gè)適合細菌休眠的環(huán)境（低溫、干燥、缺氧），使其得以長(cháng)期保存。其功能在于盡量減少菌株的傳代次數；使菌種經(jīng)保存后不死亡、不污染雜菌，并保持其原有性狀，降低菌種的變異率；最終目的是的基因不能丟失。
菌種保存的方法根據其保存時(shí)間長(cháng)短可分為三種方法：
短期保存〔數月）：采用斜面或平板保存法。斜面菌種置于4℃可保存數月，平板用石蠟膜密封后也可在低溫0～4℃下放置數月。
中長(cháng)期保存（數年）：中長(cháng)期保存采用穿刺法，這是一種菌種接入柱狀培養基的方法。經(jīng)常應用的是半固體柱狀培養基，用接種針沾取少量問(wèn)后直接插入柱狀培養基中。需注意的是，要從培養基中間插入，直插到接近管底，但不要穿透培養基，再慢慢按原途徑拔出接種針，切勿攪動(dòng)，以免使接種線(xiàn)不整齊而影響觀(guān)察，甚至會(huì )因用力攪動(dòng)造成空隙太大進(jìn)入空氣，而影響保存效果。穿刺培養的菌種用蠟封口，在室溫下可保存數年。
長(cháng)期保存菌種：主要采用甘油保存法。在7％二甲基亞（DMSO）或 15％甘油中，菌種可于- 70℃冰箱或液氮中長(cháng)期保存。當甘油含量增加40～ 50%時(shí)，細菌可在- 20℃或- 70℃條件下，保存若干年而不失活。將冰凍菌種從冰柜中取出時(shí)，應當放在冰浴上慢慢融化，不可直接將其放室溫下，否則會(huì )導致菌體失活，更不能直接接種至液體培養基內28℃振蕩培養。
3、Vir基因活化誘導物的使用
�。�1）誘導物：
常用誘導物是乙酰丁香酮（AS）和羥基乙酰丁香酮（OH－AS），其中效果優(yōu)是AS。但最近又有新的發(fā)現，有兩種特殊化合物比AS的誘導活性高10～100倍。
�。�2）誘導物的使用方法
在農桿菌液體培養時(shí)加 AS，加入時(shí)間－般在制備工程菌浸染液使用前4～6 h加入。使農桿菌既處于對數生長(cháng)期，又處于vir基因高度活化狀態(tài)，從而提高侵染能力。也有的在農桿菌懸浮液離心后用植物外植體培養基稀釋成侵染液時(shí)加入。
AS加在農桿菌和外植體共培養的培養基中。共培養的過(guò)程是Ti質(zhì)粒實(shí)現 T-DNA轉化時(shí)期。一般農桿菌附著(zhù) 16 h后才能進(jìn)行轉化，這時(shí)需要vir基因的高度活化。因此，許多科學(xué)家贊成這種使用方法。
在農桿菌液體培養基中及共培養基中都加入AS。這種方法似乎最牢靠，只不過(guò)是使用的AS誘導劑太多了。
�。�3）誘導物使用的pH值
pH值對vir區的活化有著(zhù)明顯的影響，從理論上講含AS的培養基pH值為5．0～5．6時(shí)， Vir區基因的誘導達到最高水平。
pH值改變 0．3，即對多種植物的轉化率有明顯影響。
章魚(yú)堿型和農桿堿型菌系比胭脂堿型和琥珀堿型需要更低的pH值。
通常農桿菌培養時(shí)pH值為7．2。這種生長(cháng)旺盛的菌株的vir基因均處于不活化狀態(tài)。而組織培養基中的pH值常為5．8，有利于vir基因的活化。在vir基因活化誘導中應調整培養基的pH值。
4、外植體的選擇
Mayer等指出，轉化只發(fā)生在細胞分裂的一個(gè)較短的時(shí)期內，可能只有處于細胞分裂周期的S期才具有外源基因的轉化能力，因為核基因組DNA正在復制時(shí)才能使外源DNA整合。因此細胞具有分裂能力是轉化的基本條件。
�。�1）外植體的種類(lèi)
葉片、葉柄、子葉、子葉柄、下胚軸、莖、花莖、匍匐莖、塊；莖尖分生組織、芽、根、合子胚或體細胞胚，以至成熟的種子等都可作為外植體轉化。但各種外植體材料的轉化率有明顯差異。
最佳共培養的時(shí)間：
農桿菌轉化時(shí)，并不“侵入”到植物細胞中去，而是把T－DNA轉移到植物細胞。農桿菌附著(zhù)后不能立即轉化，只有在創(chuàng )傷部位生存16h之后的菌株才能誘發(fā)腫瘤，這一段時(shí)間稱(chēng)為“細胞調節期”。因此，共培養時(shí)間必須長(cháng)于 16h。共培養時(shí)間太長(cháng)，由于農桿菌的過(guò)度生長(cháng)，植物細胞因受到毒害而死亡。共培養時(shí)間對轉化率有著(zhù)很大影響，而且不同物種、外植體種類(lèi)、農桿菌菌株的最佳共培養時(shí)間不同。
確定最佳共培養時(shí)間的方法主要采用gus基因瞬時(shí)表達測定法，即共培養后定時(shí)測定外植體的gus基因顏色反應，統計瞬時(shí)表達率及表達面積，以表達率高，表達面積大為優(yōu)。同時(shí)還要考慮外植體的受損害程度，以保證外植體的旺盛生長(cháng)為直。最后還要以獲得的轉化愈傷組織頻率或轉化不定芽頻率為最終依據。
農桿菌的增殖適度
在共培養時(shí)農桿菌增殖生長(cháng)不良，外植體切口邊緣只有很少的農桿菌生長(cháng)，則轉化的機率很小。反之，農桿菌在外值體四周過(guò)度增殖，可引起對外植體的毒害，致使其褐化死亡。 控制農桿菌增殖適度的原則是既要使菌株在外植體邊緣特別是切口面旺盛增殖生長(cháng)，又不應過(guò)度，一般以覆蓋切口面為適度。 控制農桿菌增殖的方法有以下幾種：
1）調整工程菌液的濃度，生長(cháng)太快則應降低菌液濃度。
2）控制共培養時(shí)間，農桿菌的增殖生長(cháng)適度也是確定共培養最佳時(shí)間的指標，共培養時(shí)間太長(cháng)可造成農桿菌過(guò)度生長(cháng)。
3）使用抗生素調控農桿菌的增殖生長(cháng)。一種方法是在共培養基中加入適量的抗生素如羧芐青霉素或頭孢霉素。另一種方法是共培養2～3d后的外植體需用含抗生素的液體共培養基充分洗滌，以除去過(guò)量的農桿菌，然后轉到新鮮的共培養基上繼續共培養。共培養結束時(shí)若仍存在農桿菌過(guò)度增殖，則可再用上述洗滌培養基充分洗滌后進(jìn)行愈傷組織誘導或不定芽分化培養 。 共培養中激素的影響
共培養時(shí)培養基中是否加激素，文獻報道不一，有的不加激素，有的則認為加激素后促進(jìn)外植體細胞分裂，保持細胞活力，也有利于轉化后細胞的生長(cháng)，從而提高轉化率。
如 Mansur等（1993）用 A281菌株與花生葉片外植體共培養時(shí)，加激素比不加激素的腫瘤誘導率提高約 30％。
目前大多數研究者采用加激素的方法，而且共培養基與愈傷組織誘導或不定芽誘導培養基相同。
�。�4）外植體脫菌及選擇培養 外植體的脫菌培養 脫菌培養，即把共培養外植體轉移到含有抗生素的培養基上。常用的脫菌抗生素有羧芐青霉素（Carb）、 頭孢霉素（Cef） 等。這些抗生素不僅對農桿菌有殺傷或抑菌作用，而且對植物細胞同樣有一定的生物效但對不同植物的不同外植體產(chǎn)生的影響不同。
Holford 等（1 992 ）指出，Carb 的分解物為生長(cháng)素及苯乙酸，因此 Carb 可刺激愈傷組織的增殖。Howe 等（ 1994 ）觀(guān)察到對楊樹(shù)的愈傷組織誘導有抑制作用。在甘藍研究中發(fā)現，Carb 抑制根分化，Cef 抑制芽分化，因此芽分化階段需用Carb， 生根階段則用Cef。 抗生素的使用濃度一般為500mg／L 左右。其使用原則是在達到抑制農桿菌生長(cháng)的目的后，盡量降低其濃度。
脫菌培養的時(shí)間：脫菌培養的時(shí)間，一般需5～6次繼代培養，但仍然不能把殘留的農桿菌殺死，特別是共生在維管束和細胞間隙中的農桿菌。如果停止使用抗生素后的外植體又有農桿菌可再使用抗生素脫菌。也有的植物一直使用抗生素，直到試管苗形成。
�。�5）轉化體的選擇培養
?選擇壓： 選擇抗生素如 Km，加入選擇培養基后，對細胞的生長(cháng)產(chǎn)生一種選擇作用，
稱(chēng)之為選擇壓。加入的抗生素濃度愈大，選擇壓也愈大。選擇培養基中抗生素的濃度，即選擇壓的強度，也要根據植物的特性而定，較敏感的植物要用較低的 Km濃度。一般濃度范圍是 Km 50～ 100mg／L， hpt 10~20mg／L， ppt 5～20mg／L。
?選擇的方法：前期選擇、延遲選擇和后期選擇。
前期選擇：就是外植體共培養后，在轉入愈傷組織或不定芽誘導的一開(kāi)始就加入選擇壓，相當于前面講到的先選擇后再生。
延遲選擇：當愈傷組織和不定芽誘導培養時(shí)開(kāi)始不加選擇壓，過(guò)一周或一定時(shí)間后再加入選擇壓，這樣既有利于轉化細胞生長(cháng)又不會(huì )產(chǎn)生更多的嵌合體 后期選擇：即相當于前面說(shuō)的先再生后選擇，有利于提高轉化率。
選擇培養過(guò)程中轉化和再生細胞的一致性
在選擇培養條件下再生細胞和轉化細胞是否一致，關(guān)系到能否得到真正的轉化，只有同時(shí)具有再生和轉化潛力的細胞才有可能分化成轉基因植株。因此再生部位和可被轉化的細胞部位應該發(fā)源一致，反之得到的可能是假轉化體。假轉化體在繼代選擇培養基上生長(cháng)不良而死亡，或呈白化。
七、根癌農桿菌Ti質(zhì)粒轉化的方法
1、整體植株接種共感染法
該途徑是模仿農桿菌天然的感染過(guò)程，人為地在整體植株成創(chuàng )傷部位，然后把農桿菌接種在創(chuàng )傷面上，或用針頭把農桿菌注射到植株體內，桿菌在植株體內進(jìn)行侵染實(shí)現轉化，獲得轉化的植物細胞，因此也稱(chēng)之為體內轉化。為了獲得更高的轉化頻率，一般采用無(wú)菌的種子實(shí)生苗或試管苗。它是最簡(jiǎn)便的轉化法。
優(yōu)點(diǎn)：
實(shí)驗周期短；
充分利用了這些無(wú)菌實(shí)生苗的生長(cháng)潛力；避免在轉化中其他細菌的污染；菌株接種的傷口與培養基分離，以免農桿菌在培養基上過(guò)度生長(cháng)，允許在無(wú)抗生素的培養基上進(jìn)行；
具有較高的轉化成功率。
缺點(diǎn)：
轉化組織中�；煊休^多未轉化的正常細胞，即形成嚴重的嵌合體； 需要大量的無(wú)菌苗材料； 轉化細胞的篩選比較困難。
2、葉盤(pán)轉化法
�。�1）葉盤(pán)法轉化的操作
打孔器從消毒葉片上取得葉圓片
葉盤(pán)在過(guò)夜培養的對數生長(cháng)期的農桿菌的菌液中浸數秒種后，置于培養基上共培養 待菌株在葉盤(pán)周?chē)L(cháng)至肉眼可見(jiàn)菌落時(shí)再轉移到含有抑菌劑的培養基中除去農桿菌。
同時(shí)在該培養基中加入抗生素進(jìn)行轉化體選擇，3~4周培養可獲得轉化的再生植株。
優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單、重復性高、適用性廣 （2）轉化苗的保持與繁殖
主要采用兩條途徑實(shí)現轉化苗的保持與繁殖。
營(yíng)養繁殖途徑，它包括試管苗的無(wú)性快速繁殖及嫁接、扦插等田間的無(wú)性繁殖方式。 該途徑保持繁殖轉化苗時(shí)應注意如下：
�、僬_使用激素濃度，低水平的激素能有利于保持外植體活力，并刺激休眠側生分生組織的發(fā)育及側枝形成。適當提高分裂素濃度有利于芽的分化，形成原始轉化苗的無(wú)性系克隆。因此可根據實(shí)驗目的選擇細胞分裂的濃度。
�、跒橄龤埩舻霓r桿菌在繁殖培養基中加入抑菌抗生素是明智的種子繁殖：
這對于轉基因植株的正常表達、遺傳特性及向生產(chǎn)化過(guò)渡具有重要作用。該途徑的主要操作是將轉化試管苗在小花盆中移栽成活，然后轉入田間，開(kāi)花時(shí)套袋隔離防止雜交授粉及向環(huán)境中釋放轉化的花粉。結種后注意收割種子，保存。
3、原生質(zhì)體共培養轉化方法
�。�1）操作步驟：
�、購娜~片分離原生質(zhì)體，在26t下暗培養24 h，然后轉移到2000lX下繼續培養48h；
�、谠诩毎磳⒎至�，新的細胞壁物質(zhì)已經(jīng)形成時(shí)，加入活化的農桿菌懸浮液。農桿部原生質(zhì)體的比例以1：1000左右為宜。共培養約2～3 d；
�、墼偌尤脒x擇標記的抗生素對轉化體進(jìn)行選擇培養約3～4周后可產(chǎn)生肉眼可見(jiàn)的小塊轉化愈傷組織；
�、軐⑿K愈傷組織轉移到固體培養基上再生愈傷組織，此時(shí)繼續保持選擇壓力，以便保證只有轉化愈傷組織才能不斷生長(cháng)；
�、輰⑥D化愈傷組織轉入固體分化培養基，獲得轉化再生植株。其他步驟與葉盤(pán)法相同。
�。�2）原生質(zhì)體共培養法的優(yōu)點(diǎn)及一些技術(shù)問(wèn)題原生質(zhì)體的密度一般以105～106個(gè)／ml為宜。
在農桿菌和原生質(zhì)體共培養期民農桿菌附著(zhù)在原生質(zhì)體上，超過(guò)32小時(shí)之后方可除菌洗滌，也就是要有一定的附著(zhù)時(shí)間。
原生質(zhì)體出現新形成的細胞壁物質(zhì)是農桿菌轉化的基本條件，這是因為細胞壁物質(zhì)與農桿菌的附著(zhù)有關(guān)。未形成新細胞壁物質(zhì)的原生質(zhì)體沒(méi)有農桿菌的附著(zhù)，也沒(méi)有轉化進(jìn)行。 在共培養過(guò)程中，某些二價(jià)陽(yáng)離子（Mg2+）為農桿菌的附著(zhù)和轉化所必需。二價(jià)離子的整合物EDTA可以抑制農桿菌對植物細胞壁的吸附及轉化作用，因為上述 Mg2+（不是 Ca2+）與農桿菌附著(zhù)到植物細胞壁有關(guān)。 共培養轉化似乎是在單細胞或二細胞階段發(fā)生，因此獲得的轉化愈傷組織大部分是來(lái)自一個(gè)細胞。
八、 癌農桿菌轉化系統的評述
優(yōu)點(diǎn)：
成功率高，效果好。該轉化系統是模仿或稱(chēng)之為利用天然的轉化載體系統，不管是用菌株接種整體植物的傷口，還是直接侵染離體培養細胞，通常都可以獲得滿(mǎn)意的轉化頻率。
在所有的轉化系統中，Ti質(zhì)粒轉化系統是機理研究得最清楚的，方法最成熟，應用也最廣泛。
Ti質(zhì)粒的T-DNA區可以容納相當大的DN段插入，目前已把長(cháng)達50kb的異源DNA序列通過(guò)T－DNA完整地轉移到植物細胞中。
T－DNA上含有引導DNA轉移和整合的序列，以及能夠被高等植物細胞轉錄系統識別的功能啟動(dòng)子和轉錄信號，使插入到T-DNA區的外源基因能夠隨同T-DNA一道在植物細胞中表達。
可根據人們的需要連接不同的啟動(dòng)子，使外源基因能夠在再生植株的各種測器官中特異性表達，例如在果實(shí)中表達，在葉中表達，甚至僅在根中表達，即可進(jìn)行人為地控制。
農桿菌Ti質(zhì)粒轉化系統轉化的外源基因以單拷貝為多數，遺傳穩定性好，并且多數符合孟德?tīng)栠z傳規律，因此轉基因植株能較好地為育種提供了中間選育材料。
缺點(diǎn)：根癌農桿菌Ti質(zhì)粒載體系統作為一個(gè)植物基因轉化載體系統的不足之處是它主要用于雙子葉植物，如何擴大其應用范圍如禾谷類(lèi)、裸子植物等，一直是人們所關(guān)心問(wèn)題。
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