深究DP2干預對大鼠海馬神經(jīng)元的作用論文
鋁為地殼中含量最豐富的金屬元素，人類(lèi)日常生活中應用廣泛，主要通過(guò)食物、化妝品及建筑材料等途徑攝入。經(jīng)證實(shí)，長(cháng)期攝入大劑量鋁會(huì )產(chǎn)生嚴重中樞神經(jīng)系統毒性，表現為行為和認知功能障礙、神經(jīng)元損傷，甚至神經(jīng)退行性變，但其具體機制尚不完全清楚。前列腺素(PGs)是一類(lèi)多不飽和脂肪酸衍生物，由環(huán)氧化酶(COX)催化花生四烯酸(AA)代謝產(chǎn)生，介導一系列生理病理過(guò)程。前列腺素D2(PGD2)是大腦中最豐富的PGs，其合酶(PGDS)有腦型PGDS(L睵GDS)和生血型PGDS(H睵GDS)兩種亞型。在中樞神經(jīng)系統，除少突膠質(zhì)細胞外，L睵GDS高表達于神經(jīng)元。PGD2與特異性受體DP1和DP2結合后，通過(guò)受體介導的信號傳遞機制而發(fā)揮廣泛作用。DP1和DP2都是G蛋白偶聯(lián)受體，分別偶聯(lián)Gs和Gi蛋白，影響環(huán)磷酸腺苷(cAMP)水平而發(fā)揮不同作用。有研究報道，在PGD2 致原代大鼠皮層神經(jīng)元損傷模型中，DP2 拮抗劑BAY瞮3405未發(fā)揮保護作用，推測DP2 可能不介導PGD2 的神經(jīng)毒性。另也有研究報道，在谷氨酸致原代大鼠海馬腦片損傷模型中，DP2激動(dòng)劑DK睵GD2明顯升高神經(jīng)元的LDH漏出率及細胞死亡率，提示DP2介導PGD2的神經(jīng)毒性。出現此矛盾結果，可能與研究模型不同有關(guān)。DP2作為DP受體中的一員，在鋁鹽致原代培養大鼠海馬神經(jīng)元損傷過(guò)程中具體是如何變化的，尚未見(jiàn)報道。目前廣泛研究的DP2選擇性激動(dòng)劑主要有DK睵GD2、15d睵GD2、15d睵GJ2，DP2 選擇性拮抗劑主要有CAY10471、AM461、AZD1981。參考Yue等的報道，我們選擇DK睵GD2、CAY10471作為干預藥物進(jìn)行實(shí)驗。我們前期實(shí)驗結果表明，鋁負荷原代培養大鼠海馬神經(jīng)元損傷模型中，L睵GDS表達明顯上調，DP2表達明顯下調，PGD2 含量明顯升高，初步提示L睵GDS睵GD2睤P2信號通路可能參與了神經(jīng)元損傷過(guò)程。在本實(shí)驗中，我們采用DP2選擇性激動(dòng)劑和拮抗劑分別干預鋁負荷神經(jīng)元，進(jìn)一步觀(guān)察DP2在原代培養大鼠海馬神經(jīng)元中的作用。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 實(shí)驗動(dòng)物 選取孕期18d左右的SD大鼠，由重慶醫科大學(xué)實(shí)驗動(dòng)物中心提供，合格證書(shū)號：SCXK(渝)2012-0002。
1.1.2 主要試劑與儀器 麥芽酚(阿拉丁，上海)，DMEM/F12、D睭ank′s(Hyclone，美國)，B27、Neuro瞓asal培養基、胎牛血清(Gibco，美國)，左旋多聚賴(lài)氨酸、MTT試劑盒(Sigma，美國)，青霉素-鏈霉素溶液、LDH試劑盒、Fluo3AM(碧云天，上海)，山羊抗兔特異性烯醇化酶(NSE)多克隆抗體(博士德，武漢)，SP試劑盒、DAB顯色劑(中杉金橋，北京)，蘇木精染液、伊紅染液(南京建成，南京)，DK睵GD2、CAY10471(Cayman，美國)，超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司)，二氧化碳培養箱(ThermoSci瞖ntific，美國)，超純水系統(Millipore，美國)，低溫冷凍離心機(ThermoScientific，美國)，激光掃描共聚焦顯微鏡(Bio睷ad，美國)，全自動(dòng)酶標儀(BioTek，美國)。
1.2 方法
1.2.1 大鼠海馬神經(jīng)元原代培養 取孕期18d左右的SD大鼠，斷頸后迅速剪開(kāi)腹部皮膚和腹膜，將子宮完全暴露后剪斷肌層和臍帶，取出胎鼠并立即浸泡于裝有75%乙醇的燒杯中。約30s后，將消毒好的.胎鼠移入事先準備的D睭anks液中，斷頭取腦，迅速分離出兩側完整海馬，放入冰浴的D睭anks液中，用眼科剪將海馬組織剪碎。加入組織體積5倍左右的0125%胰酶，混勻，37℃培養箱內消化，10min時(shí)拿出輕輕吹打數次。20min后，加入同體積的含10%胎牛血清培養液終止消化。200目細胞網(wǎng)篩過(guò)濾，收集細胞懸液，800r·min-1離心10min。棄去上清，加入一定量的含10%胎牛血清培養液重懸細胞，制成細胞密度為1×106·L-1的細胞懸液。吸取不同體積細胞懸液分別接種于左旋多聚賴(lài)氨酸包被好的培養板、培養皿及培養瓶中，置于37℃、5% CO2的培養箱中培養。4h后，待神經(jīng)元貼壁，換含2% B27的Neurobasal培養液繼續培養，以后每隔3d半量換液1次。海馬神經(jīng)元培養至d7時(shí)長(cháng)到較好狀態(tài)，可進(jìn)行后續實(shí)驗。
1.2.2 原代培養大鼠海馬神經(jīng)元的免疫化學(xué)鑒定 取6孔培養板中培養至d7的海馬神經(jīng)元爬片(10mm×10mm)，棄去細胞培養液用PBS漂洗3次;4%多聚甲醛固定30min，PBS漂洗3次，每次2min;3% H2O2 孵育15min，PBS漂洗3次，每次2min;10%山羊血清封閉，37℃孵育20min，吸干血清，不漂洗;NSE多克隆抗體∶抗體稀釋液(1∶50)，以PBS代替一抗設空白對照，4℃孵育過(guò)夜，PBS漂洗3次，每次5min;生物素標記山羊抗兔二抗，37℃孵育30min，PBS漂洗3次，每次5min;辣根酶標記鏈霉素卵蛋白素工作液，37℃ 孵育30min，PBS漂洗3次，每次5min;避光條件下，DAB顯色10min，自來(lái)水終止反應;蘇木精染液復染細胞核，3min后自來(lái)水返藍;95%乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片;晾干，鏡下觀(guān)察。
1.2.3 MTT測定 將96孔培養板中大鼠海馬神經(jīng)元培養至d7進(jìn)行實(shí)驗分組，即空白對照組(300μmol·L-1maltol)、鋁負荷模型組[100μmol·L-1Al(malt)3]、干預組(Al3+ +10-5、3×10-6、10-6mol·L-1 DK睵GD2、CAY10471)。在加入處理因素后繼續培養24h，每孔加入20μL的MTT溶液(5g·L-1)，37℃培養箱中孵育4h。棄去孔內上清液，加入150μLDMSO，搖床上避光震蕩，以充分溶解結晶物，于570nm波長(cháng)處測定吸光度值(OD值)。
1.2.4 乳酸脫氫酶(LDH)漏出率測定 將24孔培養板中大鼠海馬神經(jīng)元培養至d7進(jìn)行實(shí)驗藥物處理(分組同“1.2.3”)，繼續培養24h后，根據LDH測定試劑盒說(shuō)明書(shū)具體步驟操作，于490nm波長(cháng)處測定OD值。計算公式：細胞毒性或LDH漏出率/% =(處理樣品OD值-樣品對照孔OD值)/(細胞最大酶活性的OD值-樣品對照孔OD值)×100。
1.2.5 海馬神經(jīng)元病理形態(tài)學(xué)觀(guān)察 將24孔培養板中大鼠海馬神經(jīng)元爬片(10mm×10mm)培養至d7進(jìn)行實(shí)驗分組，即空白對照組(300μmol·L-1mal瞭ol)、鋁負荷模型組[100μmol·L-1Al(malt)3]、干預組(Al3+ +10-5mol·L-1DK睵GD2、CAY10471)。在加入處理因素后繼續培養24h，棄去細胞培養液，PBS漂洗3次，每次1min;4%多聚甲醛固定30min，PBS漂洗3次;HE染色，鏡下觀(guān)察。
1.2.6 Ca2+熒光強度測定 將共聚焦專(zhuān)用培養皿中大鼠海馬神經(jīng)元培養至d7進(jìn)行藥物處理(分組同“1.2.5”)，繼續培養24h。棄去培養皿中培養液，采用Ca2+熒光探針Fluo3/AM標記活細胞內Ca2+，通過(guò)激光掃描共聚焦顯微鏡測定細胞內Ca2+熒光強度。1.2.7 統計學(xué)分析 所有實(shí)驗結果均以珋x±s表示，采用SPSS17.0統計軟件進(jìn)行分析，組間比較采用單因素方差分析及Dunnett′st檢驗。
2 結果
2.1 原代培養大鼠海馬神經(jīng)元NSE免疫化學(xué)鑒定 培養至d7的神經(jīng)元，在倒置光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察，其胞體飽滿(mǎn)有光暈，軸突和樹(shù)突明顯，突起交錯連接成網(wǎng)狀。經(jīng)NSE免疫細胞化學(xué)染色后，陽(yáng)性細胞胞體及突起呈棕黃色;蘇木精復染后，陽(yáng)性細胞胞核呈藍色。隨機取6個(gè)視野，每個(gè)視野挑選100個(gè)細胞，計數NSE陽(yáng)性細胞并計算其所占百分比。統計結果顯示，超過(guò)95%為陽(yáng)性細胞(Fig1)。
2.2 DP2干預對鋁負荷原代培養大鼠海馬神經(jīng)元存活力的影響
2.2.1 DK睵GD2對鋁負荷原代培養大鼠海馬神經(jīng)元存活力的影響 與空白對照組比較，鋁負荷模型組MTT值明顯降低(P<001);與鋁負荷模型組比較，DK睵GD2干預組MTT值明顯降低，且有劑量依賴(lài)性。
2.2.2 CAY10471對鋁負荷原代培養大鼠海馬神經(jīng)元存活力的影響 與空白對照組比較，鋁負荷模型組MTT值明顯降低(P<001);與鋁負荷模型組比較，CAY10471干預組MTT值明顯升高，且有劑量依賴(lài)性。
2.3 DP2干預對鋁負荷原代培養大鼠海馬神經(jīng)元LDH漏出率的影響
2.3.1 DK睵GD2對鋁負荷原代培養大鼠海馬神經(jīng)元LDH漏出率的影響 與空白對照組比較，鋁負荷模型組LDH漏出率明顯升高(P<001);與鋁負荷模型組比較，DK睵GD2 干預組LDH漏出率明顯升高，10-5mol·L-1、3×10-6mol·L-1組差異有顯著(zhù)性(P<001。
2.3.2 CAY10471對鋁負荷原代培養大鼠海馬神經(jīng)元LDH漏出率的影響 與空白對照組比較，鋁負荷模型組LDH漏出率明顯升高(P<001);與鋁負荷模型組比較，CAY10471干預組LDH漏出率明顯降低(P<001)。
2.4 DP2干預對鋁負荷原代培養大鼠海馬神經(jīng)元病理形態(tài)學(xué)的影響 HE染色后，在正置光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察，空白對照組海馬神經(jīng)元結構清晰完整，胞體呈錐形或三角形，核仁明顯，有雙極或多極突起并相互交織成網(wǎng);鋁負荷模型組海馬神經(jīng)元細胞數目明顯減少，突起萎縮，部分細胞核固縮;DK睵GD2干預組海馬神經(jīng)細胞幾乎全部核固縮、裂解;CAY10471干預組海馬神經(jīng)元較模型組神經(jīng)元結構完整，胞體、胞核明顯，裂解細胞明顯減少(Fig2、3)。
2.5 DP2干預對鋁負荷原代培養大鼠海馬神經(jīng)元Ca2+熒光強度變化的影響 空白對照組海馬神經(jīng)元的Ca2+熒光強度極其微弱，鋁負荷模型組Ca2+熒光強度明顯增強(P<001);與鋁負荷模型組比較，DK睵GD2干預組Ca2+熒光強度有增強趨勢，但差異無(wú)顯著(zhù)性;CAY10471干預組Ca2+熒光強度明顯降低(P<001)(Tab5、Fig4)。
3 討論
鋁作為一種公認的神經(jīng)毒劑，過(guò)量蓄積可嚴重影響人的認知功能，進(jìn)而誘發(fā)一系列神經(jīng)系統疾病。與三氯化鋁、葡萄糖酸鋁等其他鋁鹽相比，麥芽酚鋁[Al(malt)3]是一種中性含鋁復合物，在生理pH條件能釋放出大量Al3+，有利于進(jìn)行鋁負荷神經(jīng)毒性的相關(guān)研究。本實(shí)驗采用Neurobasal培養基(含2% B27)進(jìn)行海馬神經(jīng)元的原代培養，通過(guò)神經(jīng)元胞質(zhì)內特異性標志物NSE的鑒定，其純度超過(guò)95%。參考Chen等[11]并通過(guò)我們的前期實(shí)驗摸索，本實(shí)驗采用100μmol·L-1麥芽酚鋁建立鋁負荷大鼠原代海馬神經(jīng)元損傷模型。研究結果發(fā)現，與空白對照組比較，鋁負荷原代培養大鼠海馬神經(jīng)元MTT值明顯降低、LDH漏出率明顯升高、Ca2+熒光強度明顯增強，海馬神經(jīng)細胞數目明顯減少、突起萎縮，部分細胞核固縮。Chen等[12]對麥芽酚鋁致原代培養的大鼠皮層神經(jīng)元損傷進(jìn)行了研究，發(fā)現Al3+通過(guò)激活Rho睷ock信號通路誘導神經(jīng)毒性。Johnson等[13]在原代培養的大鼠海馬神經(jīng)元中發(fā)現，麥芽酚鋁可造成神經(jīng)元呈時(shí)間和劑量依賴(lài)性凋亡，其作用機制可能與麥芽酚鋁抑制腦源性神經(jīng)生長(cháng)因子(BDNF)，導致細胞內Ca2+升高有關(guān)。
我們實(shí)驗結果還發(fā)現，與鋁負荷模型組相比，DK睵GD2干預組MTT值明顯降低、LDH漏出率明顯升高、Ca2+熒光強度有增強趨勢，海馬神經(jīng)細胞幾乎全部核固縮、裂解;CAY10471干預組MTT值明顯升高、LDH漏出率明顯降低、Ca2+熒光強度明顯減弱，海馬神經(jīng)元較模型組神經(jīng)元結構完整，胞體、胞核明顯，裂解細胞明顯減少。有研究報道，DP2 偶聯(lián)Gi蛋白，通過(guò)激活磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)，磷酸化絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(Ser50/Thr145)，激活糖原合成酶3(GSK3)，活化T細胞核因子的轉換，釋放炎性介質(zhì)。也有研究報道，DP2被激活后偶聯(lián)Gi蛋白，抑制cAMP水平，促進(jìn)Ca2+ 內流，上調CD11b表達，誘導嗜堿性粒細胞遷移和脫顆粒，促進(jìn)IL2、IL4、IL5、IL13的釋放。Liang等[5]對天冬氨酸(NMDA)致原代海馬神經(jīng)元損傷進(jìn)行了研究，發(fā)現DK睵GD2 加重神經(jīng)元損傷。Schroder等[16]對炎性相關(guān)因子前列腺素H1(PGH1)進(jìn)行了研究，發(fā)現CAY10471可抑制Th2細胞的遷移。結合本實(shí)驗結果，DK睵GD2可能通過(guò)激動(dòng)DP2，偶聯(lián)Gi蛋白，增加細胞內Ca2+濃度，加重鋁負荷原代培養大鼠海馬神經(jīng)元損傷;CAY10471可能通過(guò)抑制DP2活性，減少Ca2+流入，對鋁負荷原代培養大鼠海馬神經(jīng)元損傷起一定保護作用。
綜上所述，DP2 激活表達可增加神經(jīng)元對鋁鹽損傷的易感性，其機制可能涉及DP2下游Ca2+信號通路的調控，但由于作用復雜，在神經(jīng)系統中的機制尚不完全清楚。因此，在本研究的基礎上，可對DP2在神經(jīng)系統中介導的下游Ca2+信號通路的具體調控機制進(jìn)行深入研究。
【深究DP2干預對大鼠海馬神經(jīng)元的作用論文】相關(guān)文章：
蛋白激酶在缺血大鼠海馬神經(jīng)元細胞中的保護作用論文10-08
心理干預對不孕癥病患的作用論文09-22
深究RDP多肽修飾的姜黃素隱形脂質(zhì)的作用論文09-29
游泳訓練次數對大鼠空間學(xué)習記憶能力的作用論文10-14
吃海馬怎么有什么作用05-02